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pGEX-4T-2-TK原核表白质粒的构建及其表白

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毕业论文范文题目：pGEX-4T-2-TK原核表白质粒的构建及其表白，论文范文关键词：pGEX-4T-2-TK原核表白质粒的构建及其表白
pGEX-4T-2-TK原核表白质粒的构建及其表白毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标:近年来,肿瘤的基因医治始终是人们研究的热点。为了摸索自杀基因在肿瘤医治中的利用,本实验抉择存在较好保险性,重组后能很好表白的原核表白质粒pGEX-4T-2作为构建重组质粒的载体,以其表白产物能将无毒的前体药物更昔洛韦(GCV)转化成细胞毒性产物(三磷酸更昔洛韦)的自杀基因-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)作为目标基因,用分子生物学相干技巧构建pGEX-4T-2-TK重组质粒,将构建好的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)内,察看其目标蛋白表白情况及体外对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤作用,为进一步转化入双歧杆菌后是否靶向表白于肿瘤乏氧区的后续实验做筹备。方法:用小量制备质粒DNA的方法分辨提取表白型质粒pGEX-4T-2以及含有TK自杀基因的质粒pORF-HSV-TK,通过PCR方法以质粒pORF-H（本文此处忽略..）SV-tk为摸板扩增tk基因,设计高低游引物时候辨参加限度性内切酶BamHⅠ跟SalⅠ酶切点。纯化后的表白型质粒载体pGEX-4T-2与自杀基因HSV-TK分辨用限度性内切酶BamHⅠ跟SalⅠ进行双酶切后连接。将连接好的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)内,用含氨苄青霉素的LB固体培养基筛选出阳性转化菌菌落,扩增后再提出质粒行双酶切鉴定,PCR鉴定以及送英骏公司进行测序鉴定,将鉴定正确的阳性菌用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)引诱表白后,一部分行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳察看蛋白表白情况,同时另一部分增加终浓度为1mmol/L的更昔洛韦,厌氧罐厌氧培养24h后取细菌悬液10m1,离心收集上清液,真空干燥,残渣用无菌0.9%生理盐水lml溶解,由此获得处理液。同时以培养基、单纯阳性菌处理液组及单纯GC（本文此处忽略..）V组作对比,处理方法同上。各取200μl处理液作用于培养在96孔培养板中的CNE-2细胞,于37℃,5%CO2孵箱中培养24h后,用WST-1法察看各组鼻咽癌细胞存活率。成果:(1)挑取抗氨苄青霉素的单个阳性转化菌菌落,扩增后提取重组质粒行双酶切,而后行1%琼脂糖凝胶电泳得到1100kb(HSV-TK)跟4900kb(pGEX-4T-2)片段,与预计大小一致。(2)以提取出的重组质粒pGEX-4T-2-TK为模板,PCR特异性扩增HSV-tk基因,行1%琼脂糖凝胶电泳,可见扩增出的PCR产物大小约1100Kb的条带,与TK基因大小一致。(3)将pGEX-4T-2-HSVtk重组质粒送Invitrogen公司进行测序鉴定,通过两个测序反应得到两段碱基序列分辨为854bp跟872bp,去除测序引物并且连接后得到1124bp,将此段连接序列用chromas软件分析示与GENEBANK上颁布的原序列一（此处忽略..）致,无开放读码框架移位及改变,无基因渐变。(4)阳性转化菌经IPTG引诱培养后,行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,较未增加IPTG组可见目标蛋白条带产生,阐明构建的原核表白质粒成功,经引诱后可能表白目标蛋白,达到实验请求。(5)体外WST-1法察看实验组(阳性菌+GCV)CNE-2细胞存活率只有33.65%,而单纯阳性转化菌组及单纯GCV组的存活率分辨为88.29%,76.81%,,采取SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,实验组与各对比组进行组间比较,p0.05,有统计学意思。采取析因方差分析,单纯阳性菌组与单纯GCV组交互作用后与阳性菌+GCV组比拟较,P0.01,有统计学意思,表明实验组抑瘤成果,不是阳性菌组及GCV组抑瘤成果的简单相加,而是阳性转化菌表白的产物作用于前药GCV,使其磷酸化为对细胞有毒性的三磷酸更昔洛韦,从而大大进步了对（文章此处忽略..）鼻咽癌细胞的杀伤作用。论断:(1)成功构建pGEX-4T-2-tk重组质粒,经限度性核酸内切酶双酶切鉴定,特异性PCR扩增鉴定,及测序鉴定均证明重组质粒构建成功,经chromas分析软件分析示重组质粒PCR产物序列与GENEBANK上颁布的原序列一致,无开放读码框架移位及改变,无基因渐变;(2)将构建好的重组质粒成功转入大肠杆菌后自杀基因能表白目标蛋白,阳性菌与GCV独特培养后获得的处理液对CNE-2细胞有明显的克制造用。

以上为本篇毕业论文范文pGEX-4T-2-TK原核表白质粒的构建及其表白的介绍部分。

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