腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因体系的构建与体外抑瘤研究

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腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因体系的构建与体外抑瘤研究

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毕业论文范文题目：腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因体系的构建与体外抑瘤研究，论文范文关键词：腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因体系的构建与体外抑瘤研究
腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因体系的构建与体外抑瘤研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：研究背景自杀基因疗法是利用基因工程技巧将一些病毒或细菌等原核生物含有而哺乳动物细胞中不含有或表白程度极低的前药转换酶基因导入肿瘤细胞进行表白，其产物(前药转换酶)使无毒性的前药变成细胞毒物质，从而达到杀伤肿瘤细胞作用。该疗法通过直接杀伤效应跟傍观者效应杀伤肿瘤细胞，而对畸形机体细胞伤害略微，因此可能在获得良好肿瘤医治后果的同时明显降落全身毒副反应，目前已成为肿瘤基因医治研究的前沿课题。迄今研究最为深刻的两大自杀基因体系是HSV-TK／GCV跟CD／5-FC。美国FDA已经批准多项有关HSV-TK／GCV跟CD／5—FC的临床医治实验打算。鉴于不同类型肿瘤细胞对自杀基因体系的敏感性不同、单一自杀基因体系医治时部分肿瘤细胞易产生耐药以及CD／5-FC跟HSV-TK／GCV体系的作用机理存在很强的互补性，结合利用CD／5-FC跟HSV-TK／GCV两体系不仅可能进步肿瘤细胞杀伤作用，改良医治后果，而且可能扩大肿瘤医治谱，减少耐药景象产生。自杀基因疗法请求自杀基因能在肿瘤细胞特异性表白而不在畸形细胞中表白，一个能达到这一目（本文此处忽略..）标的方法是利用肿瘤组织特异性调控元件(启动子或加强子)调控自杀基因表白，如甲胎蛋白基因启动子用于肝癌自杀基因疗法、erbB2启动子用于乳腺癌自杀基因疗法等。然而这些启动子仅针对某一类型肿瘤，利用存在必定局限性。血管内皮细胞成长因子(VEGF)多少乎在所有实体瘤细胞中都有适量表白，而畸形组织中不表白或表白甚微，以VEGF启动子驱动自杀基因，可使自杀基因在肿瘤细胞特异性表白，达到靶向医治作用，而且多少乎可能利用于所有实体瘤。自杀基因疗法大多以病毒作为载体。最常用的自杀基因病毒载体有腺病毒、腺相干病毒、单纯疱疹病毒跟逆转录病毒等。腺相干病毒载体容量小，插入的外源基因小于4.7kb而且病毒滴度低(＜10~4／ml)；单纯疱疹病毒轻易引起急性细胞侵害且可改变成野生型，存在嗜神经性，重要用于神经体系疾病；逆转录病毒的外源基因能随机整合入宿主细胞，因此存在致癌性，另外它只感染决裂期细胞而且病毒滴度低(仅10~6～10~8／ml)。而腺病毒作为载体存在以下长处：1)病毒滴度高(10~(10)～10~(12)／ml)；2)感染范畴广，岂但可感染决裂期细胞，而且可感染静息期细胞；3)感染细胞时其DNA（文章此处忽略..）不整合到宿主染色体中，不潜在的致癌危险;4)可插入7一skb的外源DNA片段;5)可用于体内基因直接转移等生物学特点，因此腺病毒被广泛利用于各种基因医治，特别是肿瘤自杀基因医治。在细菌内同源重组法发明以前，制备重组腺病毒仅在少数实验室能实现。跟着分子生物学跟基因工程技巧的发展，腺病毒的制备已经绝对简化，特别是在利用AdEasier一1体系当前，重组腺病毒的制备可能在个别实验室发展，因此腺病毒载体的利用日益广泛，目前已成为自杀基因疗法的首选载体。基于以上研究，本课题拟构建腺病毒介导的VEGF启动子一CD/TK融合基因体系，并察看该重组腺病毒对LOVO细胞的体外杀伤作用，为进一步发展腺病毒介导CD/TK融合基因靶向医治大肠癌的研究提供实验根据。目标一、利用AdEasie卜1体系制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因的重组腺病毒质粒，经293细胞包装、扩增获取重组腺病毒。行氯化艳密度梯度离心纯化，并行PCR鉴定。二、利用含vEGF启动子驱动的CD/TK融合基因的重组腺病毒感染LOVO细胞，在前药5一氟胞喀睫(5一FC)跟/或更昔洛（此处忽略..）韦(GCV)作用下，测定肿瘤细胞的细胞克隆构成率跟细胞存活率以察看腺病毒介导的CD/5一FC跟HSV一T幻GCV体系对大肠癌细胞的体外杀伤效应。方法一、构建转移质粒pAdtrae卜vEGFP一englyTK首先，用Notl跟众01切下pEGFP一l一sv-vEGFP上的vEoFP，亚克隆至pAdtrack构建pAdtrack一vEGFP。再分辨以JM109细菌跟pREPS一TK为模板，PCR扩增出CD跟TK基因片段，亚克隆到旁边载体penNA3构建含CDglyTK融合基因的peDNA3一CDglyTK。用Hl’nd111跟尸vull酶切，回收纯化一大小约2.6比、含polyA尾的片段eDglyTK一pA，插入到穿梭质粒pAdtrack一vEGFP上构建转移质粒pAdtrack一vEGFP一CDglyTK，行酶切鉴定。二、构建重组腺病毒质粒pAdEasy.VEGFP一CDglyTK用Pmol酶切线性化pAd脉k一vEGFP一cDgiyTK，转化用氯化钙法制备的AdEasier-1感触态细菌，使pAdtrack一vEGFP一cDgiyTK（本文此处忽略..）跟腺病毒基因组PAdEasy一1在BJS183细菌内进行同源重组。抽提质粒，行电泳跟Pacl酶切鉴定获取正确的重组腺病毒质粒PAdEasy-VEGFP一CDglyTKo三、293细胞包装、扩增重组腺病毒用经Pacl酶切线性化的重组腺病毒质粒pAdEasy一vEJP一eDg一yTK，按LIPo化e认M取EZ000产品阐明书转染293细胞，通过荧光显微镜察看GFP的表白情况。转染后第14d收集细胞，反复冻融(一7oaC，一树37oC，3mi可振荡，lmin)4次收集病毒上清。取一/2病毒上清感染293细胞，5d后收集细胞，以雷同的冻融法收集病毒上清。如此反复取病毒上清感染293细胞进行大量扩增(共4次)，收集病毒上清。行氯化艳密度梯度离心法纯化并用紫外分光光度计测定重组腺病毒滴度。四、腺病毒介导的vEGF启动子一cDglyTK融合基因体系对Lovo

以上为本篇毕业论文范文腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因体系的构建与体外抑瘤研究的介绍部分。

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