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反转座子L1在肿瘤中的初步功能研究

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毕业论文范文题目：反转座子L1在肿瘤中的初步功能研究，论文范文关键词：反转座子L1在肿瘤中的初步功能研究
反转座子L1在肿瘤中的初步功能研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：随着功能基因组的研究深入,过去曾被称为“垃圾DNA(junkDNA)”已显示出非常重要的调控作用。其中在基因组中广泛分布,在人类基因组中有10万份以上(约占总序列的17%左右)的反转座子L(1longinterspersedrepeatedelement1,LINE-1)正被越来越多的研究所关注。L1是一种长散布重复元件,其绝大多数是以一种5’截短的形式存在,具有全长的功能性序列仅为50-100个拷贝,该序列在基因组中能自主性转座,被形容为基因组中的“舞蹈者”,其反转座是通过TPRT(target-primedreversetranscription)方式进行。在正常分化的细胞中,L1通过表观遗传学调控(启动子的高度甲基化)维持其沉默状态,但生殖细胞发育、胚胎发育的早期以及肿瘤细胞中则为激活状态。近来的研究表明在几乎所有的肿瘤细胞中L1均为激活状态,其表达与转座活性与肿瘤的发生、发展有着非常密切的关系。所以通过L1的研究对了解肿瘤发生、发展和调控的分子机理以及肿瘤药物靶标具有重要意义。研究表明在肿瘤细胞中,L1均出现不同程度的低甲基化,其激活将引发反转（略..）座发生。为了验证L1在多种肿瘤细胞中的甲基化状态的改变,我们采用甲基化敏感与非敏感的同裂限制性内切酶结合PCR扩增方法进行检测。在此过程中首先用甲基化敏感的限制性内切酶分别对不同来源的DNA进行处理,随后对位于L1启动子中酶切位点区域的上游与下游分别设计PCR引物,进行PCR扩增,如能扩增出设计大小的片段,则表明该区域没有被甲基化敏感的限制性内切酶所切开(该位点出现甲基化),反之不能被扩增,则表明该区域被甲基化敏感的限制性内切酶所切开(该位点没有出现甲基化)。实验中我们选择了同裂酶MSPI和HpaⅡ(两种酶的识别与作用序列为5’-CCGG-3’)对三种常见肿瘤细胞DNA进行酶切实验,并用正常血DNA作对照,验证其甲基化状态。结果发现在HepG2DNA中部分CCGG中C没有甲基化,即甲基化程度有所下降,而在正常血DNA、A549DNA中则HpaⅡ酶切与没有酶切的条带没有差别,MSPI酶切后电泳条带减弱不明显,H23两酶切后无明显差异,为分析其原因,对其序列测序比对表明:启动子区变异较大,多集中在CpG区域。在对L1编码蛋白的研究中（本文此处忽略..）,发现其编码蛋白ORF-1p远远过量于ORF-2p,而且ORF-1p被发现与所有的已知蛋白均没有同源性,其具体功能目前尚不十分清楚。为此,我们使用RNAi技术成功构建了两条针对L1ORF1的RNAi表达载体,通过RT-PCR以及Westernblot检测,实验结果表明:在多种肿瘤细胞中,两种RNAi表达载体均能明显降低L1的表达水平。为研究L1ORF1在肿瘤细胞中的功能,我们将上述载体转染肿瘤细胞。结果显示,通过绘制细胞生长曲线(MTT-assay测定细胞生长速度),降低L1ORF1的表达水平,能够显著抑制肺癌细胞系A549,肝癌细胞系HepG2以及乳腺癌细胞系MCF-7的生长。这表明,在多种肿瘤细胞中,L1ORF1可能发挥促进细胞生长的作用。同时,肿瘤细胞转移和侵袭的基础是锚定非依赖性生长能力。我们使用L1RNAi表达载体降低了L1ORF1的表达水平,软琼脂锚定的克隆形成实验结果发现,肺癌细胞系A549,肝癌细胞系HepG2以及乳腺癌细胞系MCF-7的锚定非依赖性生长能力显著下降,集落变小,数量减少。这表明,在多种肿瘤细胞中,L1ORF1可能与锚定非（略..）依赖性生长有关,进而有可能参与调节肿瘤细胞迁移和侵袭过程。此外,将两种L1RNAi表达载体分别转染上述三种常见肿瘤细胞系后,细胞周期检测(流式细胞技术)的结果显示:肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2等的细胞周期运转均明显阻滞,A549及乳腺癌细胞系MCF-7的细胞系阻滞在S/G2,肝癌细胞系HepG2的细胞系阻滞在G2/M。这表明,在多种常见肿瘤细胞中,L1ORF1可能在细胞周期运转的过程中发挥重要作用,促使肿瘤细胞系通过多个时相的监测点。基于ORF-1p的下调对细胞周期的显著影响,我们随后选取了两种与细胞周期相关的抑癌基因p21、p15进行相关机制的研究。在此过程中,我们利用含有p15和p21启动子序列的报告基因(荧光素酶基因)表达系统,研究使用L1RNAi表达载体降低L1ORF1表达水平后,对其进行转录活性的检测。结果表明,在肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF-7和肝癌细胞系HepG2三种恶性肿瘤细胞系中,降低ORF-1p的表达后,能够升高p21报告基因的转录活性;在肺癌细胞系A549和肝癌细胞系HepG2中,升高p15报告基因的在转录活性。但在乳腺癌（略..）细胞系MCF-7中,p15报告基因的转录活性没有明显变化。这提示ORF-1p可能通过影响p15和p21等抑癌基因的表达水平参与调控了细胞周期运转和细胞生长。同时,我们在进一步实验中,使用基因芯片技术筛选出众多与L1相关的基因及信号传导通路,为下一步实验研究拓宽了视野。综上,在肿瘤细胞中,降低了L1ORF1的表达水平后,能够显著抑制肿瘤细胞的生长,削弱其锚定非依赖性生长能力,阻滞细胞周期的运转,并导致众多基因及信号传导通路的改变。这说明,L1ORF-1的表达,可能通过多种途径,促进细胞生长,加快细胞周期运转,使细胞成瘤能力增强,从而促使细胞向肿瘤方向转化。因此,L1可能在肿瘤的发生、发展及转归中起重要作用,其编码的ORF-1有可能为肿瘤药物的开发提供新的靶标。

以上为本篇毕业论文范文反转座子L1在肿瘤中的初步功能研究的介绍部分。

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