重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定

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重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定

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毕业论文范文题目：重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定，论文范文关键词：重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定
重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：本实验对日本七鳃鳗(Lampetrajaponica)口腔腺cDNA文库1323条有效EST序列进行分析,得到一条可能翻译TCTP模体的开放浏览框,据此设计引物,以日本七鳃鳗口腔腺总RNA为模板进行RT-PCR扩增,得长为519bp的目标基因,与pET23b载体连接后,在大肠杆菌BL21中成功表白,亲跟层析纯化后得到浓度约为1.5mg/mL的L-250蛋白纯品。以获得的L-250蛋白纯品制备多克隆抗体,进行免疫印迹实验,分析抗体与目标蛋白结合的特异性,同时对表白的重组蛋白（此处忽略..）在日本七鳃鳗口腔腺中进行定位。活性实验表明L-250蛋白存在组胺开释因子(Histamine-releasingfactor,HRF)生物学功能。首先,通过基因工程的手段从日本七鳃鳗口腔腺中获得了受翻译调节的肿瘤蛋白(Translationallycontrolledtumorprotein,TCTP)的目标基因,克隆至pET23b表白载体上,再转化入克隆菌DH5α掉队行阳性转化子的筛选,之后将带有组氨酸标签的重组蛋白在E.coliBL21中进行了可溶性（文章此处忽略..）表白,经组氨酸亲跟层析柱纯化后,获取了分子量为22.4kD的TCTP纯品,将其命名为L-250。以纯化的L-250蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗七鳃鳗血清L-250蛋白多克隆抗体,ELISA法检测多克隆抗体效价可达1:6400。以日本七鳃鳗口腔腺分泌物跟表白的重组蛋白纯操行SDS-PAGE,采取免疫印迹法进行检测,发明制备的兔抗七鳃鳗血清L-250蛋白多克隆抗体可能与口腔腺分泌物跟重组蛋白均产生明显的特异性结合,L-250蛋白是一种分泌蛋白。采取大鼠嗜碱性白血病细胞系R（本文此处忽略..）BL-2H3评估L-250蛋白的HFR活性。将L-250以不同的浓度梯度(0.3,4.8,10μg/mL)与RBL-2H3孵育,成果表明,L-250可能刺激RBL-2H3开释组胺,并且在痕量(0.3μg/mL)下就可能起作用。由此可能揣测,组胺作为一种免疫介质,七鳃鳗这种寄生性生物可能通过L-250蛋白使宿主产生免疫反应,组胺还可能引起血管扩大效应,加强部分血流;另一方面,组胺还可能加强血管内皮细胞名义凝血酶调节素TM的表白,凝血酶调节素与凝血酶结合,可降落凝血酶的凝血活性,同时活化蛋白C（此处忽略..）,活化的蛋白C可能水解凝血因子Ⅴa跟Ⅷa,并且妨碍凝血因子Ⅹa与血小板的结合,还可能促进纤维蛋白溶解,这三条通路终极都会克制凝血反应。这为阐明日本七鳃鳗的吸血生活习惯提供了必定的实际根据,同时,提示L-250蛋白将在临床抗凝医治方面存在潜在的利用价值。

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