依托泊胺类化合物抗肿瘤多药耐药的作用与机制研究

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依托泊胺类化合物抗肿瘤多药耐药的作用与机制研究

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毕业论文范文题目：依托泊胺类化合物抗肿瘤多药耐药的作用与机制研究，论文范文关键词：依托泊胺类化合物抗肿瘤多药耐药的作用与机制研究
依托泊胺类化合物抗肿瘤多药耐药的作用与机制研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的:评价新型新型依托泊胺类化合物的体内体外抗肿瘤活性及抗肿瘤多药耐药作用,对活性高、毒性小的化合物开展抗肿瘤作用机制的深入研究。方法:采用分子对接模拟VP-16及化合物5a-5n(共14个化合物)与拓扑异构酶Ⅱ(TopⅡ)-DNA复合物的结合能力;MTT法评价化合物5a-5n体外抑制K562、A549以及U251人肿瘤细胞增殖作用,计算IC_(50)值;TopoⅡ介导的DNA剪切-重连接复合物稳定性实验测定5k-5n(5k,5l,5m,5n)对TopoⅡ活性的影响;实时荧光定量PCR法及westernblot法验证HL60R及KBR细胞中MDR1基因转录水平及p-gp蛋白的表达水平;MTT法评价化合物5k-5n及VP-16的体外抗肿瘤多药耐药活性;鼠源性肉瘤S180小鼠移植瘤模型评价5k的体内抑瘤活性;人口腔上皮癌KB及耐药株KB/VCR裸小鼠移植瘤模型评价5k的体内抗肿瘤多药耐药活性;P-gpATP酶活性检测p-gP底物;采用PI结合流式细胞术检测细胞周期变化;免疫荧光观察CyclinB1蛋白在细胞核内外分布;PI及Annexin-Ⅴ染色结合流式细胞术检测细胞凋亡;Westernblot法检测各周期或凋亡相关蛋白含量及活性;Carboxy-DCFDA染色结合流式细胞术检测活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)含量变化;JC1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,ΔΨm)变化;LC-MS/MS测定5k体内血药浓度。结果:1、5k-5n对K562、A549和U251人肿瘤细胞均有较好的抑制生长作用,IC_(50)值均＜15.0μM,明显低于VP-16在该肿瘤细胞株上的IC_(50);2、5k-5n能稳定DNA与TopoⅡ形成的共价复合体从而抑制TopoⅡ活性,对TopoⅡ的抑制活性高于相同剂量的VP-16;3、5k-5n对药物敏感的白血病细（本文此处忽略..）胞株(HL60,KB)及相应的高表达p-gp耐药白血病细胞株(HL60R、KB/VCR)均有较好的抑制作用,IC_(50)值均小于2.0μM,其耐药倍数(RF值)分别为2.7、2.2;而VP-16在HL60R及KB/VCR上的IC_(50)值分别为36.5μM、158.8μM,RF值分别为13.4及11.3;4、5k-5n对KBR细胞株MDR1基因mRNA的表达水平及p-gp蛋白表达水平均无显著影响,即5k-5n不能通过直接作用于p-gp蛋白产生抗肿瘤细胞多药耐药作用;5、Pgp-Gloassaysystem试剂盒检测p-gpATP酶活性显示5k并非p-gp的完美底物,这可能是5k抗多药耐药的重要因素;6、在荷S-180鼠肉瘤细胞的小鼠实验中,5k10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg以及阳性对照VP-1610mg/kg组的抑瘤率分别为85.5%、36.7%、39.6%和62.4%,5k高浓度组抑瘤率明显优于阳性对照VP-16组;7、裸小鼠KB及KB/VCR人口腔上皮癌细胞移植瘤实验结果显示,在KB移植瘤模型上5k(2.5mg/kg)组及VP-16(5mg/kg)组均表现出较好的抗肿瘤作用,其T/C%值分别为53%和59%,抑制率分别为59.2%(P＜0.01)和60.2%(P＜0.01);在多药耐药株KB/VCR移植瘤模型上,5k(2.5mg/kg)组表现出明显的抗肿瘤活性,其T/C%值为45%,而VP-16组的T/C%值为72%,5k在多药耐药肿瘤KB/VCR模型上的抑瘤率比VP-16(5mg/kg)组高2.4倍;8、20μM的5k作用KB细胞2h能诱导γ-H2AX磷酸化水平的高表达,与之相比,相同浓度的VP-16诱导γ-H2AX蛋白表达效果不明显,说明5k诱导肿瘤细胞的DNA损伤较VP-16更高效;9、低浓度的5k能诱导KB细胞周期阻滞于G_2/M期。5k表现出比VP-16更强的诱导KB细胞周期阻滞能力,80.0nM5k作用24小时能使91.7±5.1%KB细胞周期阻滞于G_2/M期,而160.0nMVP-16同样作用仅能使58.3%的KB细胞阻滞于G_2/M期,且5k诱导的KB细胞周期阻滞呈时间与剂量依（此处忽略..）赖性关系;10、免疫荧光实验结果显示,在5k诱导G_2/M期阻滞的KB细胞中,CyclinB1蛋白表达显著上调,并且此时的CyclinB1蛋白主要集中分布在细胞质中,由此推断,5k诱导的KB细胞周期阻滞于G_2期而非M期;11、westernblot结果显示,20.0、40.0、80.0nM5k作用KB细胞24h使细胞内cyclinB1水平随5k剂量的升高而显著上调,而在Cdc2蛋白水平变化不明显的同时其磷酸化水平(Thr161位点)随5k作用剂量的上升而下调。此外,在5k的作用下能诱导Cdc25C(Ser218)、Chk1(Ser317)、Chk2(Thr68)的磷酸化水平上调,但是,观察到Chk1蛋白略有下调,而Ch2蛋白基本不变。此外,20.0nM-80.0nM5k作用KB细胞24小时后,P53以及p-P53(Ser20)蛋白表达水平略有上调,其下游蛋白P21表达上调也不明显。说明5k可通过影响KB细胞中周期调节蛋白,诱导KB细胞阻滞于G_2期;12、2mM的咖啡因预作用30min能逆转5k对KB细胞的周期阻滞作用,提示我们ATM/ATR激酶与5k诱导的DNA损伤相关。同时,与逆转周期阻滞作用一致,咖啡因预作用同样能逆转由5k诱导的Cdc2Thr161位点磷酸化的下调、Chk1Ser317位点磷酸化及Chk2Thr68位点磷酸化的上调,阻止CyclinB1蛋白的累积;13、AnnexinV/PI双染结合流失细胞术,定量检测凋亡结果显示,1.25μM、2.5μM和5μM5k作用KB细胞48h分别能够诱导KB细胞发生凋亡,凋亡率分别为34.56%、48.00%、59.80%(空白对照为8.54%),呈剂量依赖性关系;14、westernblot结果显示,相对应的1.25μM、2.5μM和5μM5k作用KB细胞48h可使细胞内procaspase3、procaspase9的表达下调,并检测到小分子量的裂解片断(cleavedprocaspase3和cleavedprocaspase9);与此同时也观察到被水解的caspase-3的底物P（文章此处忽略..）ARP,而抑凋亡蛋白XIAP在5k作用后下调,且5k的以上作用均优于同剂量的VP-16,说明5k诱导细胞凋亡过程中激活了caspase级联,5k诱导的细胞凋亡是caspase依赖性的;15、JC-1染色结合流式细胞术测定细胞线粒体膜电位变化显示2.5μM5k作用KB细胞48h可使71.6%KB细胞呈现绿色荧光(即ΔΨm降低),并且呈时间依赖性关系;16、Carboxy-DCFDA染色并结合流式细胞术检测细胞内ROS的含量显示2.5μM5k作用KB细胞0h、1h、2h、3h后细胞绿色荧光强度随时间延长而上升,在3h达到最大值为阴性对照的3.5倍,随后开始下降。然而,用PI结合流式术检测其凋亡率后发现,2.5μM5k作用于KB细胞48h,能使73.5±7.5%的细胞发生凋亡或坏死,而500.0μMNAC(ROS抑制剂)预作用3h后再加入5k同样能使79.9±6.3%的细胞发生凋亡或者坏死,提示抑制5k诱导的ROS升高并不能抑制5k诱导的凋亡;17、Wenternblot法检测蛋白表达水平显示,1.25μM、2.5μM、5.0μM5k以及5.0μM分别作用于KB细胞48h后,Bax蛋白表达水平略有上调,Bcl-2略有下调,因此Bax/Bcl-2的比例总体呈上升的趋势;此外,2.5μM5k作用于KB细胞6、12、24以及48h后,分别提取线粒体蛋白及胞浆蛋白,检测各部分Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果显示,胞浆中的Bax蛋白表达改变不明显,然而与线粒体膜电位的变化一致,线粒体内的Bax蛋白表达在5k作用48h时上调明显,意味着在5k的作用下能促进Bax蛋白进入线粒体,促使PT孔的开放,而这也与线粒体膜电位的改变密切相关。18、采用LC-MS/MS法检测5k的血药浓度结果显示,单次给予KB细胞移植瘤裸小鼠5k2.5mg/kg10min后其体内血药浓度达到1.67±0.19μM,而经24h代谢后,体内5k血药浓度降至低于0.034μM,由此可推测5k在体内表现的抗肿瘤作用中诱导肿瘤细胞（本文此处忽略..）周期阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡两种作用机制并存。结论:5k在体内和体外均有较好的抗肿瘤以及抗肿瘤多药耐药作用,为一非常有前景的抗肿瘤侯选药物。5k以TopoⅡ为靶点,能诱导大量DNA损伤,在低浓度5k作用下,该DNA损伤能通过ATM/ATR通路作用于周期蛋白,最终诱导细胞周期阻滞于G_2期;而在高浓度下5k作用下,该DNA损伤能通过影响Bcl-2家族蛋白的表达和活化,改变线粒体膜电位,最终激活线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡。

以上为本篇毕业论文范文依托泊胺类化合物抗肿瘤多药耐药的作用与机制研究的介绍部分。

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