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柑桔溃疡病菌的PCR疾速检测技巧研究

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毕业论文范文题目：柑桔溃疡病菌的PCR疾速检测技巧研究，论文范文关键词：柑桔溃疡病菌的PCR疾速检测技巧研究
柑桔溃疡病菌的PCR疾速检测技巧研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：柑桔溃疡病(CitrusBacterialCankerDisease，CBCD)是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.citri,Xac)引起的一种影响寰球柑桔产业发展的国内外重大检疫性病害。其重要通过显症或带菌种苗、接穗、果实等柑桔材料的调运进行远间隔传播，田间病害重要靠病菌随风夹雨扩散，病菌在天然状况下的存活期较长。对该病的检疫测验，除传统的方法外，近年来国外己发展了PCR测验技巧，但现有技巧在特异性跟牢固性等方面还存在着一些问题，制样技巧亦复杂费时，并且国内外均无合适实际利用的检测试剂盒研制的报道。我国参加WTO当前，柑桔溃疡病检疫的新局势急切请求树破一种疾速、灵敏、正确的分子诊断跟测验技巧体系，而国内尚无这方面的研究报道。研究目标：本研究通过检测牢固性好、灵敏度高的特异性引物的设计与筛选，无害化参照体系的构建，简便疾速的浸泡制样技巧研究跟常温储藏检测试剂盒的研制（略..），旨在树破起疾速正确而又牢固保险的柑桔溃疡病菌PCR检测技巧体系，实现大量柑桔样品的疾速测验，为柑桔非疫出产区建设跟病害预警监测提供一种分子检测技巧跟实用工具。研究方法：利用引物跟探针设计软件PrimerPremier5.0进行引物的设计；通过扩增靶片段序列在核苷酸序列数据库中进行类似性比对的方法跟近缘细菌进行PCR扩增的方法验证了检测的特异性；通过对不同浓度的柑桔溃疡病菌DNA跟菌液的PCR扩增测定了检测的灵敏度；通过在不同DNA扩增仪跟温度把持方法下的扩增程序调试以及在不同实验室的验证测试保障了检测的牢固性。将靶片段与克隆载体连接后，用CaCl_2法转化大肠杆菌(JM109)，而后通过测序来验证PCR扩增的正确性；以重组质粒跟转化的大肠杆菌构建了无害化参照体系。利用浸泡稀释法优化了制样技巧；采取预混PCR反应液中参加生物活性分子牢固剂并冷冻干燥固相化包被处理的方法研制出能常温储存的便利有效的检测试剂盒。利用优化的分子（文章此处忽略..）检测体系对四川、广西、湖南跟重庆等地采集的柑桔样品进行了PCR实际检测，并且部分样品进行了分别培养跟致病性测定验证。研究成果：1)基于柑桔溃疡病菌A菌系染色体中的独有保守蛋白基因设计筛选的引物JYF5/JYR5，用于柑桔溃疡病菌的PCR检测存在很高的特异性、灵敏度跟牢固性。扩增的靶片段序列在核苷酸序列数据库中类似性比对成果显示：数据库中不与该对引物配对的序列，与扩增靶片段配对的最长序列也仅42bp。实际检测表明，柑桔溃疡病菌各菌系均能扩增出靶带，而柑桔叶面腐生菌、柑桔溃疡病菌近缘种以及健康柑桔组织浸提液都扩增不出靶带，显示了该对引物高度的特异性。检测的灵敏度：菌液可达10个靶细菌/25μL，DNA可达1.56pg/25μL(25μL为一个反应体积)。PCR扩增前提经优化后，在不同热轮回仪跟不同的温度把持方法下检测均可得到牢固的成果，但扩增程序有必定的差别。.西南农业大学2004届硕士学位论文逐个逐个逐个逐个逐个逐个逐个止1呈一2)克隆测序成果与己报道的靶序（本文此处忽略..）列比对成果显示，二者序列完全一致。这表明PCR扩增产物为预计靶DNA片段，验证了PCR扩增的正确性。因为该菌是重要的检疫性有害生物，不宜以活菌作为检测的阳性对比，而加热灭活的菌液因保存期限短，池不宜作为阳性对比，本研究采取转化的大肠杆菌菌液或重组质粒DNA作为阳性对比，不仅后果幻想，而且可能防比检测过程中检疫性有害生物在环境中的扩散。3)制样技巧采取浸泡法，4种浸泡液中，以浸泡液B的浸提后果最好，室温下，最佳浸泡时光为10min一巧min·浸提液进行加热灭活处理与否，犷CR扩增无明显差别。实际检测中模板的用量对PCR扩增有必定影响。对无症柑桔样品，浸泡液中参加终浓度为0.3%的NaZSO:可能降落动物色素、多元酚等pCR克制物质的烦扰作用。带菌样品浸提液经过富集跟离心处理，不仅可能有效稀释靶细菌，进步检测灵敏度，而且可能去除柑桔组织咆外的部分PcR克制物质(动物色素、多元酚、氯原酸以及铜基杀菌剂残留的cuZ+等)，明显降落了（略..）检测的假阴性。4)预混pcR反应液中参加适量的生物活性分子牢固剂(MS)，存在牢固PCR反应混淆液中生物大分子的作用，混淆液中MS与HZO的体积比为1:】时其牢固后果最佳。含有MS的预混PCR反应液的多少种储存处理中，以冷冻干燥处理后常温储存储存的预混PCR反应液的保存期最长，至少可能保存7个月，其它多少种储存处理方法的保存期均不超过1个月。采自四川、广西、湖南跟重庆等地的柑桔样品PCR检测成果表明，全部样品的均匀阳性检出率为50.67%。部分样品的分别培养跟致病性测定成果，基本验证了PCR检测的正确性。检测成果与各地实际病害产生情况吻合。论断:本研究成功地树破了疾速正确而又牢固保险的柑桔溃疡病菌PCR检测技巧体系。该技巧可能J一‘泛地用于疑症样品鉴定、病害预警监测、出入境检疫以及柑桔非疫出产区建设等方面。

以上为本篇毕业论文范文柑桔溃疡病菌的PCR疾速检测技巧研究的介绍部分。

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