蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

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蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

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毕业论文范文题目：蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定，论文范文关键词：蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定
蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：血栓性疾病是严重危害人类健康的疾病之一,而利用溶栓剂治疗血栓病的溶栓疗法被认为是最为有效的方法。据统计,全世界每年有血栓栓塞性病人约1700万,所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。因此,寻找和研制新型、高效、安全的溶栓药物并实现高效高活性表达,对于更有效地治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。Fibrolase是来自美国铜头蝮蛇毒的一种锌金属蛋白酶,具有纤溶活性而无出血活性。Alfimeprase(ALF)是Fibrolase的N端突变体体(前3个氨基酸EQR由Ser取代),与Fibrolas（略..）e具有同样的溶栓功能,由美国Nuveo公司研制开发并申请了专利,其I期关于治疗慢性周围动脉血栓(PAO)和II期关于治疗周围静脉导管栓塞病(CVAD)的临床试验结果显示,ALF不仅是一种直接快速呈剂量相关的溶栓剂,而且很有希望成为第一个快速、高效、安全的蛇毒基因工程溶栓药物,现已开始用于治疗急性PAO和CVAD的III期临床试验。由于毕赤酵母(P.pastoris)表达系统是目前较完善的高效异源蛋白表达系统,具有高分泌表达、高稳定整合、易于高密度发酵和产物的下游纯化等优点,所以本（此处忽略..）研究采用该系统对ALF的高效高活性表达进行了研究。研究通过双酶切从构建好的克隆载体p43-alf上获取目的基因his6-alf,将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K和pPICZαA,经高效电转化、筛选鉴定、甲醇诱导表达获得了重组ALF(rALF)高表达菌株GS115/pPIC9K-his6-alf,KM71/pPIC9K-his6-alf和GS115/pPICZαA-his6-alf。SDS-PAGE和Westernblotting分析表明rALF的分子量约为23.8kDa,且能与小鼠抗His·tag的（文章此处忽略..）单克隆抗体特异结合,这说明rALF获得了特异表达。通过对培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和诱导时间的优化,三种重组菌中rALF的表达量分别高达510mg/L、465mg/L和425mg/L。同时可见pPIC9K-his6-alf重组菌中KM71重组菌比GS115重组菌表达的rALF更纯,而GS115重组菌单位体积表达液中rALF的表达量更大。三种重组菌的优化表达液经His·bind柱纯化后,rALF纯度分别高达94.8%、96%和95%。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果表明rALF获得了高活性分泌表达,且其纤溶活（略..）力呈现出剂量相关性和时间依赖性。另外,rALF的电泳检测和混合纤溶活性测定分析结果显示:对于rALF的高效高活性分泌表达而言,pPIC9K载体相对较优越于pPICZαA载体,而GS115和KM71菌株之间的优越性并无明显差别。结论:研究通过系列操作确立了一种高效高活性优化表达体系,为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。

以上为本篇毕业论文范文蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定的介绍部分。

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