志贺毒素A、B亚单位基因的克隆表白及抗体系备

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志贺毒素A、B亚单位基因的克隆表白及抗体系备

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毕业论文范文题目：志贺毒素A、B亚单位基因的克隆表白及抗体系备，论文范文关键词：志贺毒素A、B亚单位基因的克隆表白及抗体系备
志贺毒素A、B亚单位基因的克隆表白及抗体系备毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：志贺毒素(ShigaToxin，ShT)重要是Ⅰ型痢疾志贺氏菌(ShigelladysenteriaeserotypeⅠ)产生的一种蛋白类外毒素，ShT是由A+5B亚单位组成，ShT-A为活性单位，存在N-糖苷酶活性；ShT-B为结合单位，与细胞膜名义受体Gb_3结合，介导ShT-A发挥生物活性。ShT存在肠毒性、细胞毒性跟神经毒性跟克制真核细胞蛋白质合成等生物活性，与中毒性腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒症(HUS)等重大并发症密切相干。ShT是一种毒性极强的生物毒素，小鼠LD_(50)为0.002μg／kg，近年来已被国际社会列入生物兵器核查清单剂中的11种生物毒素之一，成为潜在的生物毒素战剂跟生物可怕病原。因此，发展ShT-A、B基因的相干研究，存在非常重要的医学跟军事意思。本实验是利用基因重组DNA技巧发展了ShT-A、（此处忽略..）B亚单位基因的克隆及在E.coli中表白，并制备小鼠多克隆抗体，为ShT疾速诊断方法的树破奠定基本。(1)根据GeneBank中的Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A、B亚单位基因序列，删除信号肽序列，设计5条三对引物，分辨在引物5’端引入相应的酶切位点，引物序列具体如下：ShT-A上游引物：P15’-cgggatccaaggaatttaccttagac-3’(BamHⅠ)下游引物：P25’-cgcggtaccctcaactgctaatagttc-3’(KpnⅠ)下游引物：P35’-agcctcgagactgctaatagttctgc-3’(XhoⅠ)ShT-B上游引物：P15'-cgcggtaccacgcctgattgtgtaact-3’(KpnⅠ)下游引物：P25’-cccaagcttacgaaaaataacttcgct-3’(HindⅢ)(2)以Ⅰ型痢疾志贺菌（文章此处忽略..）体为模板，通过PCR扩增获得了成熟ShT-A、B亚单位基因片段，与pGEM-T载体连接后，经PCR跟酶切鉴定正确后并测序，用DNAsis软件分析测序成果。(3)将ShT-A基因分辨插入到表白载体pQE30跟pET-21a(+)中，构建重组质粒pQE30-A_2跟pET-21A_1，分辨转化到表白宿主菌M15跟BL-21(DE3)中，经IPTG引诱，察看目标基因蛋白表白情况。从引诱菌成长曲线上初步证明了ShT-A基因对大肠杆菌的成长有必定的毒性克制造用。（4）根据ShT－A存在生物酶活性，能克制某些大肠杆菌的成长。利用ShTA基因序列中现存的限度性酶切位点Hindlll，进行大片段的基因渐变，将A基因切出大小为sl3bp的片段，插入到pQE30，构建重组质粒pQE30人。；。，转化到M15中，经IPTG引诱，察看目标蛋白表白情况及表白情势。成果表明该（此处忽略..）截短片段的重组基因蛋白得到高效表白，表白量占菌体总蛋白的37．1％。表明该截短的ShT－A基因渐变情势降落了ShT－A对大肠杆菌的成长克制造用及ShT－A对大肠杆菌核糖体翻译过程的克制造用。有助于目标基因蛋白的表白。u）将ShTB基因分辨插入到的团0跟pQE40表白载体中，构建重组质粒PQE30－BZ跟PQE40－B3，转化到M15中，经IPTG引诱，察看目标蛋白表白情况及表白情势。（6）超声破菌体分别表白的包涵体，用smow尿素溶解后，在变性前提下，重组ShT－B包涵体蛋白经MCAC法得到一步纯化。在非变性前提下，可溶性蛋白经MCAC法一步纯化。MCAC法疾速纯化重组蛋白，为抗原的大量制备提供了技巧保障。（）采取谷耽甘肽再氧化法对pQE30BZ跟pQE40－B3表白的包涵体进行柱后复性。经MCAC柱上逐步降落尿素浓度poE30－（本文此处忽略..）A513包涵体蛋白进行复性，使得纯化跟复性一步实现。摸索了对包涵体蛋白复性的方法。（8）以纯化的重组蛋白ShT－A跟ShT－B，免疫昆明鼠结合腹腔打针S180细胞，收集腹水，成功制备了鼠抗ShT－A跟ShTB的多克隆抗体。用间接ELISA测抗体效价。经Westernblot鉴定：该腹水抗体均与相应的目标蛋白产生特异性结合。为ShT诊断抗体的制备奠定了物质基本。同时表明用该方法制备的多抗存在量大、效价高、疾速、所需抗原量少、本钱低等长处。是今后值得推广用于制备多抗的一种好的实验方法。

以上为本篇毕业论文范文志贺毒素A、B亚单位基因的克隆表白及抗体系备的介绍部分。

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