抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲跟层析的利用

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抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲跟层析的利用

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毕业论文范文题目：抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲跟层析的利用，论文范文关键词：抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲跟层析的利用
抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲跟层析的利用毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7是一种重要的新发人畜共患感染病病原菌。自1975年被首次分别、1982年被确认为致病菌以来的近30年中，世界各地包含中国都有不同范围的暴发风行。EHECO157：H7感染可使人产生多种并发症，其中以溶血性尿毒综合症(hemolyticuremicsyndrome，HUS)迫害最为重大，可导致逝世亡。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。同时，O157：H7菌培养轻易、繁殖敏捷、感染力强、感染道路广泛，使之极有可能作为将来军事斗争中的细菌战剂跟生物可怕战剂。目前，对EHECO157：H7感染仍缺乏有效的医治方法。临床上针对其感染重要采取抗生素医治及相应的对症医治。早先的研究发明，抗生素使菌体决裂，导致O157：H7菌志贺毒素(Shigatoxin，Stx)的开释程度大大进步，利用抗生素有可能加重病情，增加产生并发症的危险并引起逝世亡。而针对Stx的特异性抗体可能会在医治该菌感染上，发挥较大的作用。EHECO157：H7重要产生两种毒素，分（本文此处忽略..）辨称为志贺毒素Ⅰ(Stx1)跟志贺毒素Ⅱ(Stx2)。两种毒素均由1个A亚单位跟5个B亚单位组成，A亚单位存在细胞内毒性，能与28SrRNA作用从而克制蛋白质合成；B亚单位存在细胞结合特点，能与存在特定糖鞘脂受体(Gb_3)的细胞结合，从而领导A亚单位发挥作用。研究证明Stx2毒性强于Stx1，与溶血性尿毒综合症(HUS)等重大并发症的相干性更为密切。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基本，是幻想的制备中跟毒素的特异性抗体的靶抗原。同时，获得天然的Stx2是研究其毒性作用机理、筛选更有效的疫苗候选靶点、制备特异的基因工程抗体、解析其蛋白质晶体构造等的先决前提。应用单克隆抗体亲跟层析法是纯化目标蛋白的特异有效道路。基于以上意识，本研究从以下多少个方面进行抗志贺毒素ⅡB亚基(Stx2B)单抗的研制及其亲跟层析的研究1．抗志贺毒素ⅡB亚单位(Stx2B)单克隆抗体的制备与鉴定方法以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原，免疫Balb／c小鼠，以不免疫的Balb／c小鼠脾细胞为豢养细胞；应用细胞杂交瘤技（本文此处忽略..）巧制备，应用间接ELISA法筛选产生针对Stx2B的单克隆抗体细胞株；体内诱生法产生腹水，饱跟硫酸铵积淀法初步纯化，再采取HiTraprProteinA柱进一步纯化；MouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit鉴定McAb的Ig亚型，采取间接ELISA法鉴定抗体亲跟常数，进行Vero细胞毒性保护实验。成果获得3株产生针对Stx2B的单克隆抗体细胞株1H9、1H10、3E5，Ig亚型分辨为IgG_1κ型，IgG_(2a)κ型，IgG_(2b)κ型，亲跟力常数分辨为7．36×10~8、6．94×10~8、5．85×10~8。3株单抗在体外均能中跟Stx2毒素，克制Stx2对Vero细胞的细胞毒作用，与无关抗体1D6比较，差别极明显，p0．01；等同剂量的抗体，克制率不同，1H101H93E5，无明显差别，p0．05；50％克制率时3株单抗的剂量约为0．2-0．3μg。论断3株细胞株产生的抗Stx2B单抗均存在必定的中跟活性，中跟活性最强的为1H_(10)。2．抗志贺毒素B亚单位单克隆抗体辨认表位的初步鉴定方法应用生物信息学方法，对Stx2B(1-72aa)全蛋白进（略..）行表位猜测，选取Stx2B全蛋白的23aa跟54aa地位作为截短位点；从EHECO157：H7EDL933基因组中扩增Stx2B50(23-72aa)跟Stx2B54(1-54aa)，克隆于pET-22b(+)载体，转化到工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)中。用IPTG引诱表白融合蛋白。对表白产物进行Tris-Tricine-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。成果McAb1H_9跟1H_(10)可能辨认Stx2B跟Stx2B50；McAb3E_5可能辨认Stx2B、Stx2B50跟Stx2B54。论断McAb1H9、1H_(10)辨认的抗原表位位于55-72aa，McAb3E_5辨认的抗原表位位于23-54aa。3．免疫亲跟层析纯化天然志贺毒素Ⅱ(Stx2)方法将McAb1H_(10)与CNBr-activatedSepharose4B填料偶联，制备免疫亲跟层析柱；用丝裂酶素C引诱EHECO157：H799A021表白Stx2，以其培养上清制成Stx2初提物；初提物上柱进行纯化，并用多种方法鉴定纯化产物。成果纯化后样品进行SDS-PAGE，在32KD跟8KD处明显看见蛋白条带，免疫印迹、DuopathV（本文此处忽略..）erotoxinsKit、细胞毒性实验(CD_(50)为2pg)跟动物攻毒实验(LD_(100)为5ng)鉴定出该纯化蛋白为天然Stx2。论断利用免疫亲跟层析成功纯化出天然Stx2。综上所述，本研究获得了存在毒素中跟活性的抗Stx2B单克隆抗体，对其抗原辨认表位进行了初步鉴定，树破了免疫亲跟层析方法，成功纯化出天然Stx2，为当前的研究奠定了坚实的基本。

以上为本篇毕业论文范文抗志贺毒素ⅡB亚基（Stx2B）单抗的研制及其亲跟层析的利用的介绍部分。

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