幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关基因片段的筛选及克隆分析

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幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关基因片段的筛选及克隆分析

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毕业论文范文题目：幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关基因片段的筛选及克隆分析，论文范文关键词：幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关基因片段的筛选及克隆分析
幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关基因片段的筛选及克隆分析毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)感染是慢性胃炎、消化性溃疡的主要病因，也是胃癌及胃黏膜相关淋巴样组织(mucosaassociatedlymphoidtissue，MALT)淋巴瘤的危险因素。甲硝唑因其在胃部的高稳定性及高活性而成为根除Hp的首选药物之一，而Hp对甲硝唑的耐药问题正日益突出，已成为根治失败的主要原因。临床上Hp的分离、培养是较困难而复杂的工作，从而导致Hp的药敏试验很难在临床广泛开展。有必要深入了解Hp的耐药机制，在此基础上运用分子生物学的方法进行药敏试验，指导临床用药；同时也为耐药性逆转的研究打下基础。Hp对甲硝唑耐药的机制尚未明确，目前认为可能与以下因素有关：①硝基还原酶活性的降低；②细菌代谢状态及酶系统的变化；③药物摄入减少或外排增加；④DNA的修复能力增加；⑤氧清除能力增加，无效循环增加。Goodwin等报道Hp对甲硝唑耐药的分子机制主要是由于编码氧不敏感NADPH硝基还原酶的rdxA基因的突变失活。另外也可能与编码氧敏感硝基还原酶的fdxB和frxA（略..）基因及编码DNA修复酶的recA基因等的突变相关。近年来，国内外学者已经克隆到一些耐药相关基因，如rdxA、fdxB、frxA、recA等，但这些尚不能完全解释Hp对甲硝唑的耐药现象，是否存在其他耐药相关基因及耐药机制有待进一步研究。抑制差减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技术是近年来建立浙江大学硕一士学位论文的一种新的“表型克隆”法，无需事先知道起作用基因的背景资料，可凭表型直接分离差异基因，是筛选耐药基因的有效手段。本实验首次运用SSH技术筛选对甲硝哇耐药和敏感的Hp菌株间的差异表达基因片段，并对所获差异片段进行克隆、特异性鉴定、测序及同源比较，以期寻找与耐药相关的基因片段，为耐药机制的进一步阐明打下基础。实验方法1.幽门娜杆苗的分离培养所有Hp临床菌株均分离自胃粘膜活检标本。Hp标准株NCTC11637由浙江大学病原生物学教研室保存并提供。病人胃粘膜组织匀浆后接种于含8%羊血的哥伦比亚琼脂平板上，在5%02、10%COZ、85%N:的微需氧环境中37℃培养3一sd。2.药敏试验纸（略..）片扩散法初筛，二倍平皿稀释法确定Hp菌株对甲硝哇的耐药性。二倍平皿稀释法的甲硝哇浓度为0.25一128。留ml，Hp菌株接种量为1x10“CFU/5川，微需氧培养72h。抑菌圈直径共7~、最小抑菌浓度(Mlc))8林留ml判为甲石肖哇耐药株。3.墓因组DNA提取采用常规的苯酚一氯仿法。基因组DNA提取后用Rsal酶切16h，再用酚:氯仿:异戊醇抽提，回收备用。4.SSH按照ClonteehPCR一SeleetTMBaeterialGenomeSubtraction丸t(PT3170一l)说明书进行。寡核昔酸接头及PCR引物均由试剂盒提供。差减杂交分别以5株耐药菌为被检菌，1株敏感菌为参考菌进行。整个差减杂交实验流程如下:将酶切后的被检菌DNA均分成两份，一份与接头1连接，另一份与接头ZR连接;然后将过量的酶切后参考菌DNA分别加入2个连有不同接头的被检菌DNA反应管中，98℃变性1.5min，然后63℃退火1.sh，进行第1次差减杂交;再将过量的事先已变性好的参考菌DNA与2个被检菌反应管同时混合，直接63℃退火过夜，进行第2次差减杂交;经2轮差减杂交后以整个出子群体为模板，采（此处忽略..）用两接头外侧的共用引物(5‘一cTAATAcGAcTcAc肠钉’AGGGc一3’)进行第l次pCR扩增。条件如下:94oC305;66oCJoS;72OC1.5min，25cyeles。最后以第1次PCR产物为模板，以两接头内侧的巢式引物1(5‘一TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT一3’)和巢式引物ZR(5’浙江大学硕士学位论文一AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT一3‘)进行第2次PCR扩增。条件为:94oC305二68oC305;72oCl.sm认，25eyeles。产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。5.SSH产物的克隆和鉴定将第2次PCR扩增的目的片段用35PCR产物纯化试剂盒进行纯化，然后克隆至pUcm一T载体中，转化于E.cohDHS。株进行扩增及蓝白筛选。随机挑选120个白色菌落扩增后用碱变性法提取质粒，再以质粒DNA为模板，以两接头内侧的巢式引物进行PCR扩增鉴定有无插入片段及片段大小。6.斑点杂交将PCR扩增的差异DNA片段纯化浓缩、变性后点制到尼龙膜上，点制8张尼龙膜，经80℃烘箱烘烤Zh后保存、备用。取实验株以外的耐药和敏感菌各4株，其基因组DNA以Rsal酶切并纯化后（此处忽略..），用Klenow酶随机引物地高辛标记法合成探针。将尼龙膜如℃预杂交2h后与探针50℃杂交ZOh，梯度洗膜封闭后以anti一dig.Apmixture进行检测。同时分别设立235rRNA(HP)、pBR328为阳性和阴性对照。7.侧序及同源分析对明显差异DNA片段委托上海申能博彩生物科技有限公司进行单向测序，并用Blast(basieloealalignmentsearehtool)与核酸数据库GenBank进行核甘酸序列同源性检索(blastn)，取最高同源性检索结果。结果1.药敏试脸临床分离的42株Hp(24株来自溃疡病患者，17株来自慢性胃炎患者，1株来自胃癌患者)中，31株Hp的Mlc多8林留nil，耐药率为73.8%。从中挑取5

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