粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达

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粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达

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毕业论文范文题目：粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达，论文范文关键词：粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达
粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆及表达毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACC)是脂肪酸合成代谢中的关键酶,它催化乙酰辅酶A生成丙二酰单酰辅酶A,后者是脂肪酸合成中二碳单位的供体,因此乙酰辅酶A羧化酶也成为脂肪酸合成代谢中的限速酶,被广泛应用于转基因油料作物研究中。本研究主要结果如下：利用简并PCR和染色体步移法首次克隆获得产油粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)ACC基因的全长序列信息。序列分析表明,该基因（略..）包含两个内含子,分别位于42-147bp和315-677bp处,编码区域总长为6801bp,推导的氨基酸序列进行二级结构分析具备乙酰辅酶A羧化酶典型的三个功能域：生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶(CT)。粘红酵母中ACC为多功能单亚基型酶,单体分子量在200kD以上,从整体角度对编码该酶的基因进行异源表达十分困难,因此仿效多亚基型ACC的研究方法对粘红酵母ACC的功能域基因进行研究。本文分别利用两套原核表达体系pET-28a（文章此处忽略..）/BL21(DE3)和pETDuet-1/Transetta(DE3)对粘红酵母ACC的三个功能域基因进行了独立表达和共表达,成功构建了9个表达载体。SDS-PAGE分析表明三个功能域基因在两套表达体系中均成功实现了单独表达,并且还实现了BC和CT两个功能域的共表达以及三个功能域的共表达。所有重组表达菌株利用水浴法抽提脂肪酸后进行气相色谱分析,结果如下：在pETDuet-1/Transetta(DE3)表达系统中,独立表达功能域BC（本文此处忽略..）或CT,共表达BC和CT二者及共表达BC、BCCP和CT三者获得的重组菌株较对照脂肪酸含量分别提高了15.4%、27.07%、35%、70.62%,只有单独表达功能域BCCP的重组菌株脂肪酸含量下降5.06%。而在pET-28a/BL21(DE3)表达体系中,重组表达菌株的脂肪酸含量较对照没有任何提高。由此证明在pETDuet-1/Transetta(DE3)表达系统中外源基因实现了功能性表达,BC和CT独立表达或共表达均能不同程度地提高脂肪酸含量,当三个功能域实现共（文章此处忽略..）表达时显著促进脂肪酸的积累。本研究还利用SOE-PCR去除了粘红酵母ACC基因内的两个内含子,并将ACC的cDNA全长分为三个片段：EK、KS、SX,依次连接到毕赤酵母表达载体pPICZaA上,构建了ACC全长表达载体,为后续真核表达和功能研究奠定基础。

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