基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的实验研究

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基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的实验研究

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毕业论文范文题目：基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的实验研究，论文范文关键词：基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的实验研究
基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的实验研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：膀胱癌是我国泌尿体系最常见的恶性肿瘤，据统计大概75％的病例为浅表性膀胱癌，其中95％为高危浅表性肿瘤。高危浅表性肿瘤术后若不给予任何药物医治，其近期复发率为60％-90％。手术、放疗、化疗构成了肿瘤医治的三大模式。这些医治方法基本都着眼于直接杀伤肿瘤细胞，常难彻底毁灭肿瘤细胞又易伤及畸形组织，特别是在医治的同时会侵害在机体抗肿瘤防备机制中占重要地位的免疫体系，尤其是影响机体的细胞免疫。在古代分子生物学跟基因工程技巧的飞速发展的推动下，肿瘤的生物学医治日益受到人们的器重，显示出良好的利用前景，成为肿瘤医治的第四模式。基因医治是生物学医治的一个重要组成部分。其发展已有近三十年的历史，在肿瘤医治中最存在潜力。据统计至1996年底，全世界接收基因医治的患者总数达2103人，其中恶性肿瘤占68.8％。众多学者关注的自杀基因医治是利用基因工程技巧将一些病毒或细菌基因组中前药转换酶基因(也叫自杀基因)导人肿瘤细胞，该基因编码特别的酶，可使本来对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞的逝世亡，所以又称为“病毒导向的酶解前药疗法”或“分子化疗”。胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)基因医治就是其中之一，且其研究获得了令人凝视标成绩。该酶可将核苷类似物(NA)代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下生成有毒的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用，同时其能抉择性地使抗病毒药物环氧鸟苷(Gan（文章此处忽略..）ciclovir，GCV，目前肿瘤TK基因医治中最常用的前药)磷酸化成为单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶的作用下构成三磷酸产物，烦扰、阻断DNA的畸形合成跟细胞增生。在肿瘤的医治中，单纯疱疹病毒-胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-TK)基因被认为最有效，也是独一被批准进入临床实验的自杀基因。其可将GCV转化为三磷酸GCV，后者代替脱氧三磷酸鸟苷酸结合于DNA链，禁止DNA链延长，抉择性杀伤处于增殖决裂期的自杀基因细胞。介导HSV-TK的真核表白载体重要有逆转录病毒(Retrovirus)、腺病毒(Adenovirus，Ad)、腺相干病毒(Adeno-AssociatedVirus，AAV)等；也可不经载体介导直接将质粒裸DNA进行转导。在已经报道的各种波及HSV-TK基因医治的体内外实验中，因为抉择的基因转移方法不同，可使HSV-TK发挥的作用不尽雷同。本课题借助已被成功包装为有复制缺点的含目标基因HSV-TK的腺相干病毒颗粒上风，结合细胞培养跟动物豢养技巧，进行杀伤膀胱癌细胞及裸鼠膀胱癌模型抑癌作用的实验研究。该项研究旨在为随后的动物原位模型体内实验、含两个或两个以上目标基因的肿瘤基因医治实验等系列研究奠定实际基本，同时为膀胱癌等肿瘤疾病的医治开辟一个新的研究平台。第一部分基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医（略..）治膀胱癌的体外细胞实验研究目标：1．通过察看基因转染T24膀胱肿瘤细胞的后果，证明含目标基因HSV-TK的腺相干病毒基因转染T24细胞的可行性。2．利用HSV-TK腺相干病毒进行体外T24膀胱肿瘤细胞的实验研究，察看其对肿瘤细胞凋亡的影响、细胞成长克制造用跟时光-剂量依附性。方法：1、以rAAV-EGFP转染T24膀胱肿瘤细胞，来断定腺相干病毒转染T24细胞的最适MOI值。2、已被成功包装为有复制缺点的含目标基因HSV-TK的腺相干病毒对T24膀胱肿瘤细胞的进行基因转染并得到鉴定，来研究其可行性。3、体外培养膀胱肿瘤细胞系T24，接种于96孔板，分辨参加rAAV-HSV-TK、rAAV-MCS重组腺相干病毒颗粒，并参加含不同浓度GCV，以不加GCV的细胞为对比，做MTT实验，研究rAAV-HSV-TK／GCV体系对T24细胞杀伤的剂量依附性。4、体外培养膀胱肿瘤细胞系T24，接种于24孔板，参加rAAV-HSV-TK重组腺相干病毒颗粒，并参照GCV杀伤的剂量依附性成果，每2天换含不同浓度GCV的新鲜培养液。从加GCV当天起，每天、每浓度做吖啶橙／EB染色计存活细胞，研究rAAV-HSV-TK／GCV体系对T24细胞杀伤的时光依附性。5、流式细胞仪断定T24细胞的凋亡。6、用10μg／mLGCV作用于rAAV-HSV-TK组细胞24、48、72小时后，流式细胞仪检测细胞周期及DNA含量的变更，察看所研究rAAV-HSV-TK／GCV体系对（文章此处忽略..）T24膀胱肿瘤细胞周期的影响。成果：1、断定了腺相干病毒转染T24细胞的最适MOI值为1×10~6v.p.／cell。2、提取病毒感染后的细胞基因组，PCR扩增目标片段，1％凝胶电泳与预期序列一致，阐明重组腺相干病毒存在生物活性，可能转染T24细胞。3、转HSV-TK基因T24细胞传代培养后，提取细胞基因组，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳及测序成果均正确，阐明转HSV-TK基因T24细胞可能牢固携带TK基因。4、跟着GCV浓度加大或GCV作用时光延长，T24细胞存活率大幅度降落，浮现明显的时光-剂量依附性杀伤作用，而且对未转染细胞无明显毒副作用。5、rAAV-HSV-TK／GCV体系可能引诱膀胱肿瘤细胞凋亡。6、T24膀胱肿瘤细胞呈现24～48小时代间碰壁于G1期；而从48～72小时代间，碰壁滞于S期，并且有明显的亚G1期峰呈现，表示凋亡细胞可能占到10％左右的百分比。第二部分基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的动物体内实验研究目标：构建裸鼠膀胱肿瘤模型，利用HSV-TK腺相干病毒结合GCV进行荷瘤裸鼠的实验研究，分析其抑瘤作用。方法：1、T24细胞悬液接种于裸鼠腋窝皮下，接种细胞数为4×10~6，SPF前提下豢养。2、取已成瘤裸鼠15只，随机分为3组：空白对比组、rAAV-MCS跟rAAV-HSV-TK组(此组同时每天腹腔打针GCV3mg／只)，每组5只，测量各组裸鼠移植瘤体积，组间无差别(p＞0.05)。医治4周后，颈椎脱臼处死荷瘤裸鼠，对移植瘤进行（本文此处忽略..）惯例HE染色。各组裸鼠，处死后敏捷取心、肝、脾、肺、肾组织，惯例HE染色察器重组腺相干病毒对各器官是否有影响。成果：1、裸鼠接种膀胱肿瘤细胞T24后约3周，接种部位呈现肉眼可见肿块，据此成功树破了膀胱肿瘤模型。2、各组裸鼠用药医治，每3天测量各组体积，约9天后，瘤内打针rAAV-HSV-TK组的肿瘤受到明显克制。医治结束后，各组肿瘤的体积分辨是：rAAV-HSV-TK组(0.71±0.11)cm~3、rAAV-MCS组(1.27±0.13)cm~3跟空白对比组(1.24±0.17)cm~3。统计分析：rAAV-HSV-TK组与阳性对比与阴性对比比较，差别均有明显性(p均＜0.05)；rAAV-MCS组与空白对比组比较，差别不明显性(p＞0.05)。3、肿瘤组织石蜡包埋后HE染色，病理学检查验证皮下种植瘤。各组裸鼠心、肝、脾、肺跟肾组织HE染色显微镜下察看，未见细胞变性或坏逝世。论断：体内外实验研究显示宿主细胞可能表白出目标基因，rAAV-HSV-TK／GCV体系能有效克制膀胱癌。

以上为本篇毕业论文范文基因重组HSV-TK腺相干病毒结合GCV医治膀胱癌的实验研究的介绍部分。

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