三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立

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三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立

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毕业论文范文题目：三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立，论文范文关键词：三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立
三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料,但是却被不法商贩添加到食品、饲料、乳制品中,作为“假蛋白”来提高产品或制品的蛋白含量。目前研究表明,三聚氰胺长期摄入则会造成生殖、泌尿系统的损伤、膀胱和肾脏结石,甚至可进一步诱发膀胱癌。因此应建立一种快速、简便、准确、灵敏的检测技术,以避免三聚氰胺通过食物链而危害人类的健康。首先,以BSA和OVA为载体,采用重氮法合成免疫抗原三聚氰胺-BSA和检测抗原三聚氰胺-OVA,使用聚丙烯凝胶电泳对合成抗原进行分析,用BCA法测定合成抗原含量分别为三聚氰胺-BSA平均蛋白浓度1917.10μg.mL-1和三聚氰胺-OVA平均蛋白浓度3546.68μg.mL-1,使用紫外分光光度计测定三聚氰胺和载体蛋白的偶（此处忽略..）联比率分别为三聚氰胺-BSA17.8和三聚氰胺-OVA26。其次,利用合成的三聚氰胺-BSA以腹腔注射途径免疫6周龄健壮活泼雌性Balb/c小鼠,以5μg.mL-1三聚氰胺-OVA包被酶标板,利用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价。经五次免疫,每次间隔21d,选择血清效价最高的小鼠进行细胞融合(≥1：16000),将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3350作用下进行融合,利用已建立的间接ELISA方法筛选出阳性克隆,采用有限稀释法进行克隆,得到一株能够稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的细胞株3G4,其染色体数目在93条左右,抗体亚类鉴定试剂盒鉴定该单抗的重链为IgG2b,轻链为κ,轻链分子质量约32KD,重链分子质量约54KD,分子质量约为172KD,纯化后纯度可达80%以上；（略..）经连续传代40次,反复冻存、复苏,仍能稳定分泌抗三聚氰胺抗体,用间接ELISA方法检测细胞上清液效价均在1：1600以上,生长状态良好,且无污染情况；用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化的腹水抗体纯化前效价为1：5×105(P/N2.337),纯化后效价为1：105(P/N3.098),亲和力常数为2.28×107L.mL-1,且与载体蛋白无交叉反应性。最后,利用抗三聚氰胺单抗建立了间接竞争ELISA方法,并对其进行条件优化。采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0μg.mL-1,最佳包被时间为4℃包被过夜,最佳封闭条件为4%脱脂乳37℃封闭2h,最佳抗体工作浓度为1：1000,最佳竞争方式为板内竞争,最佳竞争时间为37℃孵育2h,最佳酶标二抗稀释度为1：70000,最佳二抗作用条件为37℃孵育45min,最佳底物作用时间为（文章此处忽略..）15min。根据以上条件绘制标准曲线,校正曲线范围为0.1ng～1mg,线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997),计算出三聚氰胺最低检出限为2ng.mL-1(OD最低检出限=90.33%),IC50为0.527μg.mL-1,敏感度为6.236～20.985μg.mL-1。根据交叉反应率的抑制率,计算出三聚氰胺与三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的交叉反应率分别为29.88%、13.36%、0%。批内CV平均值为3.05%,批间CV平均值为7.4%,确定此方法精确度良好。利用已建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),计算三聚氰胺在各样品中的回收率,得到回收率范围分别为宠物食品73.8%-84.32%,平均达到79.06%；小麦面筋67.3%-88.27%,平均达到77.79%；饲料70.3%-85.9%,平均达到78.1%；牛乳83.（略..）47%-89.76%,平均达到86.62%；鸡蛋76.2%-87.29%,平均达到81.75%,确定此间接竞争ELISA方法能够较准确的测定样品中的三聚氰胺含量。

以上为本篇毕业论文范文三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立的介绍部分。

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