实时荧光定量PCR检测膀胱移行细胞癌尿CK20方法建立及初步临床应

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实时荧光定量PCR检测膀胱移行细胞癌尿CK20方法建立及初步临床应

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实时荧光定量PCR检测膀胱移行细胞癌尿CK20方法建立及初步临床应毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的:构建pMD18-T-CK20重组质粒标准品,利用Taqman探针技术,建立一种简便、快速、灵敏和特异的实时荧光定量检测尿CK20方法,用于膀胱移行细胞癌(transitionalcellcarcinomaofbladder,TCCB)早期诊断、预后及复发监测。方法:1.培养膀胱癌T24细胞株,扩增CK20基因片段,并克隆入T-A载体构建pMD18-T-CK20重组质粒作为定量检测的标准品,用酶切、PCR、测序鉴定。2.设计针对CK20基因的引物和Taqman探针,建立实时荧光定量PCR(Real-timePCRorFQ-PCR)CK20检测方法,探讨最佳反应条件和反（文章此处忽略..）应体系,并进行方法学评价(包括线性范围、灵敏度、特异性、重复性)。3.将本法初步用于临床,检测60例TCCB患者、20例泌尿系非恶性肿瘤患者和15例健康志愿者尿CK20mRNA表达,同时进行尿脱落细胞学HE染色检测。结果:1.标准品制备:成功构建重组质粒pMD18-T-CK20,经PCR、酶切和测序鉴定与预期结果一致,符合定量PCR标准品要求。2.定量PCR方法建立及评价:①实时荧光定量PCR两步法的最佳反应条件为:95℃预变性5min,95℃变性30sec,51℃退火70sec;最适反应体系为:总体积25μl:10×PCRbuffer:2.5μl,MgCl(225mmol/l):3.5μl,dNTPs(2.（文章此处忽略..）5mmol/l):2μl,Taq(5U/μl):0.35μl,正义、反义引物(10pmol/μl)均为:2.2μl,Taqman探针(10pmol/μl):2.2μl,cDNA:2μl,灭菌蒸馏水:8.05μl。②方法学评价:该法线性范围较宽(102～109copies/μl),灵敏度高(102copies/μl)、特异性好,重复性好(批内CV值为1.59%;天间CV值为2.34%)。3.初步临床应用:①该法检测60例TCCB患者,以CT值为30为诊断阈值,灵敏度为85%(51/60),高于尿脱落细胞学HE染色46.7%(28/60);特异性为94.3%(33/35),尿脱落细胞学特异性为100%,两方法检出率差异有统计学意义(P0.01)。②TCCB组CK20表达(Mean27712.95copies/ul)大于泌尿系非恶（此处忽略..）性肿瘤组(Mean74.72copies/ul)和健康志愿者组(Mean8.61copies/ul),差异均有统计学意义(p0.01)。③TCCB组按G1、G2、G3分级CK20表达分别为(Mean21680.5、30985.82、36333.89copies/ul),G1和G2级差异有统计学意义(p=0.016);按Tis/Ta、T1-2、T3-4分期CK20表达分别为(Mean20672.16、29213.19、35585.63copies/ul),Tis/Ta和T1-2期差异有统计学意义(p=0.022)。结论:所建立实时荧光定量PCR方法操作简单、灵敏度高、特异性好、结果数据化,适合临床实验室用于尿CK20mRNA定量检测,有望用于临床TCCB早期诊断、预后及复发监测,并有助于鉴别疾病分期、分（文章此处忽略..）级。

以上为本篇毕业论文范文实时荧光定量PCR检测膀胱移行细胞癌尿CK20方法建立及初步临床应的介绍部分。

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