PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究

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PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究

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毕业论文范文题目：PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究，论文范文关键词：PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究
PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：前言急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)亦称急性髓细胞白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)M3型,约占成人AML的10%-15%。目前研究显示,95%的APL患者细胞遗传学有特异性t(15;17)(q22;q21),导致15号染色体上PML基因(早幼粒白血病基因)和17号染色体上的RARα基因(维甲酸受体基因)形成PML-RARα融合基因,这是APL发病的关键机制,但并非是唯一机制。近来研究表明PML-RARα转基因小鼠同时发生FLT3(一种Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶型受体)突变可以导致小鼠快速发生APL,提示Ras-MEK1/2(mitogen-activatedextracellularregulatedkinase1/2,丝裂原活化细胞外调节激酶)-ERK1/2(extracellularsignal-regulatedkinase1/2,细胞外信号调节激酶)信号转导途径的异常在APL发生中也起到重要作用。Ras-MEK1/2-ERK1/2信号途径是一个小GTP结合蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶级联反应,在多种肿瘤组织与细胞中检测到该途径的异常活化。PD98059是一种MEK1特异性抑制剂,能够特异性阻断ERK1/2激酶MEK1对ERK1/2的磷酸化活化,导致G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡。鉴于此,我们以急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60为研究对象,探讨PD98059对HL60细胞信号转导的影响及其作用机制,以期为白血病的基础研究和临床治疗探寻一条新途径。目的探讨MEK1抑制剂PD98059对急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导以及细胞增殖的影响。材料和方法一、细胞系HL60细胞,由中国医科大学遗传实验室惠赠二、试剂PD98059购自Promega公司;RPMI1640购自GIBCO公司;胎牛血清购自中国医学科学院工程研究所;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT（文章此处忽略..）)、碘化丙锭(PI)均购自Sigma公司;M-MLV、DEPC处理水(RnaseFreeH_2O)、Ribonucleaseinhibitor(HPR-I)、dNTP、ExTaq、DL2000DNAMarker、Oligod(T)Primer均购自TaKaRa公司;RT-PCR引物由TaKaRa公司合成。三、试验方法1、细胞培养HL60细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,在37℃、5%CO_2、饱和湿度的培养箱中培养;每48h换液一次。2、MTT法测定HL60细胞生长的抑制情况收集对数生长期的HL60细胞,无血清培养液培养12h,以6×10~4/ml接种于96孔培养板,每孔100μl,然后加入100μl不同浓度的PD98059,使其终浓度在HL60细胞中依次为0、20、40、80μmol/L,培养24h、48h、72h;向每孔加入MTT溶液20μl,避光培养4h后,1000rpm离心10min,弃上清,每孔加入DMSO150μl,震荡均匀后酶标仪上测定490nm波长处吸光度(A)值。3、流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期对数生长期的HL60细胞,无血清培养液培养12h,1×10~5/ml接种于培养瓶,每瓶5ml,不同浓度的PD98059处理细胞,其终浓度分别为0、20、40μmol/L,培养24h、48h后,收集1×10~6个细胞至离心管,800rpm离心6min,4℃预冷PBS洗涤2次,4℃70%乙醇固定过夜,4℃PBS洗涤2次,PI4℃避光染色30min,流式细胞术检测凋亡、G0/G1期细胞的比率。4、半定量RT-PCR法检测ERK2、Skp2、p27基因表达水平对数生长期的HL60细胞,无血清培养液培养12h,1×10~5/ml接种于培养瓶,每瓶10ml,不同浓度的PD98059处理细胞,其终浓度分别为0、20、40、80μmol/L,培养48h后,收集细胞,Trizol液提取细胞总RNA,将RNA浓度调整为3mg/ml,逆转录成cDNA,加入不同引物后进行PCR扩增,β-actin作为内参,扩增产物经10000×GeneFinder染色后2%琼脂糖凝胶电泳,条带经紫外显色光密度扫描,半定量检测ERK2、Skp2、p27基因（本文此处忽略..）表达水平的改变。四、统计学处理实验数据用(?)±s表示,采用统计软件SPSS15.0进行统计学分析。结果一、PD98059作用HL60细胞后细胞的生长情况PD98059对HL60细胞生长有抑制作用,PD98059浓度为20μmol/L时,随着作用时间的延长,其对HL60细胞的抑制作用增强,但48h较24h差异无统计学意义,PD98059浓度为40或80μmol/L时,随着作用时间的延长抑制作用显著增强(P＜0.05);PD98059作用HL60细胞24h时,20μmol/L组较对照组差异无统计学意义,作用48h或72h,PD98059对HL60细胞的抑制作用存在剂量依赖,不同浓度组与对照组以及各浓度组之间差异显著(P＜0.05)。二、PD98059对HL60细胞凋亡和细胞周期的影响20μmol/L的PD98059处理HL60细胞24h时即出现细胞凋亡,与对照组比较差异显著,并且浓度相同时,随着PD98059作用时间的延长凋亡增加,而作用时间相同时,随着PD98059作用浓度的增加凋亡亦增加(P＜0.05);PD98059作用HL60细胞,24h时未发生明显的G0/G1期阻滞,而48h后G0/G1期阻滞明显增强(P＜0.05)。三、PD98059对HL60细胞ERK2、Skp2、p27基因表达影响随着PD98059浓度的增加,HL60细胞ERK2、Skp2基因表达水平下降,p27表达增加,差异具有显著性(P＜0.05)。讨论Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导系统是最近十几年才开始研究的,与细胞的生长、增殖、分化等过程的调节以及肿瘤的发生有着密切的关系。无论是正常细胞还是肿瘤细胞,Ras-MEK1/2-ERK1/2信号途径均能促进细胞由G0/G1期进入S期。研究发现,Ras-MEK1/2-ERK1/2信号途径激活后既可以通过调节Bad、Mcl-1、caspase9、Bcl-2等分子的表达来调控细胞的凋亡,亦可以调节细胞周期相关因子cyclinD1、CDK2、p21、p27等的表达,促进细胞从G0/G1期进入S期,从而调控细胞周期进程。PD98059是一种MEK1特异性抑制剂,能够阻断MEK1对ERK1/2的磷酸化活化,阻碍细胞外刺激信号转导至APL细胞及其核内,从而（文章此处忽略..）影响细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物学效应。ERK1/2的激活能够调节白血病细胞的增殖和生存,研究显示,在大多数初治AML患者中Ras-MEK1/2-ERK1/2系统被激活,并且与预后有关。Dong-OhMoon等发现PD98059能够减少cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4的表达,同时增加p21、p27、p16的表达,导致白血病U937细胞发生G1期阻滞,大剂量的PD98059能够引起细胞凋亡。在APL的发生发展中,Ras-MEK1/2-ERK1/2信号系统与CDKI家族的p21关系研究较透彻,而该途径与p27之间的关系报道较少。本实验中将PD98059作用于白血病细胞系HL60细胞,可观察到明显的细胞生长抑制现象,结果显示,随着PD98059浓度增加或作用时间的延长,细胞的抑制率增加;PD98059能够使HL60细胞发生G0/G1期阻滞,诱导细胞凋亡,此作用具有剂量依赖性与时间依赖性,与文献报道一致。HeinSchepers等报道指出Ras-MEK1/2-ERK1/2信号途径是通过增加Skp2(s-phasekinaseassociatedprotein2,S-期相关蛋白2)的表达,促进p27的泛素化降解,从而促进白血病细胞增殖,说明Ras-MEK1/2-ERK1/2信号途径能够调节p27的蛋白表达;本实验结果显示PD98059作用于HL60细胞后,Ras-MEK1/2-ERK1/2通路阻滞,ERK2mRNA表达减少,同时其下游分子Skp2的mRNA表达减少,p27的表达增加,说明Skp2作为Ras-MEK1/2-ERK1/2信号途径的下游分子受其调控,进而调节p27的表达,调节细胞周期进程。实验中,我们观察到,PD98059对HL60细胞增殖的抑制作用随着浓度的升高而增强,表现出浓度依赖性。但是PD98059并不能完全抑制HL60细胞的增殖。即使80μmol/LPD98059作用48h,细胞抑制率也未能达到50%。说明在APL发仓?Ras-MEK1/2-ERK1/2通路异常只是其中的一个发病机制,其他因素如染色体易位形成的基因异（此处忽略..）常(PML-RARα融合基因)也可能引起其它信号转导的异常,应进一步研究从而揭示白血病发生发展的机制,以发现新的治疗途径。结论PD98059能够抑制HL60细胞的生长,诱导细胞发生G0/G1期阻滞,促进其凋亡,这可能是通过PD98059阻断HL60细胞的Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导,影响了ERK2、Skp2、p27等的表达而实现的。

以上为本篇毕业论文范文PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究的介绍部分。

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