带有绿色荧光蛋白标记的中国马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的

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带有绿色荧光蛋白标记的中国马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的

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毕业论文范文题目：带有绿色荧光蛋白标记的中国马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的，论文范文关键词：带有绿色荧光蛋白标记的中国马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的
带有绿色荧光蛋白标记的中国马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：一、研究背景跟目标马感染性贫血病毒(EIAV)与人免疫缺点病毒(HIV)、猴免疫缺点病毒(SIV)、猫免疫缺点病毒(FIV)、牛免疫缺点病毒(BIV)、绵羊梅迪-维斯纳病毒(MVV)跟山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)同属于反转录病毒科慢病毒属,是重大迫害人类跟动物健康的病原体。它们在基因组构造、病毒复制的分子机制、抗原漂移、细胞噬性、病毒的生活周期、免疫机理及病毒与宿主彼此作用等方面都极为类似。其独特特点是侵害宿主免疫体系,在单核—巨噬细胞或淋巴细胞内持续增殖。但EIAV作为慢病毒属的一员,除存在一些慢病毒独特特点外,还有其独具的特点。EIAV埋伏期只有多少天至多少周而不像其余慢病毒属高达多少年,而且,可产生高滴度的病毒血症、激烈的临床病理学表示,在EIAV感染过程中,新的抗原变异株的呈现与疾病复发相干,因此其是研究慢病毒与宿主彼此作用过程中抗原变异的极好模型；与其它慢病毒感染明显不同的是,慢性EIAV感染经历一年左右的时光变为隐性感染,病毒的表白长期被克制,大部分马在感染EIAV后有畸形的寿命,部分感染马终极能把持住病毒的复制。因此,鉴定这种免疫保护机制,对慢病毒疫苗的研制存在重要的领导意思。我国科学家在20世纪70年代利用经典的异体传代跟细胞工程方法,将一株来源于马体的EIAV超强毒力毒株LN经过驴体持续传代115余代使病毒毒力加强后获得了驴强毒株DV(对马跟驴均100%致逝世),而后将DV株持续通过驴白细胞进行体外培养驯化,使得病毒毒力完全丧失,而保持了良好的免疫原性,终极成功培养出EIAV驴白细胞弱毒疫苗DLA[6](沈荣显等,1979),该疫苗免疫接种动物不仅能产生富强长久的免疫力,而且能抵抗同源跟异源强毒株的（略..）攻打。即便强毒株攻打免疫动物,其也不受感染。经过严格的保险测验,此疫苗在中国广泛推广利用,使得马感染性贫血病在中国得以有效把持。到目前为止,该疫苗是世界上独一成功利用的慢病毒弱毒疫苗。接种该疫苗后的马能耐受致逝世剂量的EIAV的攻打。这也使得我国EIAV弱毒疫苗免疫保护及致弱的机理研究成为当今慢病毒免疫基本实际研究的热点之一。其传代培养致弱的分子机制及弱毒、强毒与接种动物彼此作用的致病、免疫机制都将丰富慢病毒的基本实际,并将为包含HIV在内的其它慢病毒疫苗的研制提供重要的实际根据。自上世纪八十年代在发明HIV-1拱后,寰球更是对EIAV的分子生物学开展了广泛研究并获得了很多成果,尤其是反向遗传技巧的发展为慢病毒的研究提供了新的思路。利用该技巧在1998年成功构建的多少株不同毒力的EIAV感染性分子克隆,为揭示病毒毒力及其与宿主彼此作用的机制打下坚实基本。马慢病毒受体1(ELR1)是近年来发明的(2005),其属于肿瘤坏逝世因子受体超家族蛋白,目前认为它是EIAV的独一受体。EIAV的env基因编码gp90跟gp45糖蛋白。名义糖蛋白存在于病毒囊膜中,大小约为90kDa,是高度糖基化的蛋白,构成病毒纤突的柄,与宿主细胞膜上的受体彼此作用。EIAV进入靶细胞的方法是：病毒囊膜中的gp90与受体ELR1结合,在低pH环境下(pH4.8-5.3)经过细胞内吞作用进入细胞。其可能单独支撑EIAV血清强毒跟细胞适应毒进入非EIAV靶细胞进行增殖,但研究表明其发挥效应时可能须要其它帮助受体的独特作用,同时是否像HIV一样有帮助受体的存在尚无定论。在感染性克隆上参加荧光基团标记物标记将有助于潜在受体确切定。本文对已有的疫苗株感染（此处忽略..）性克隆进行GFP分子标记,并将构建的感染性克隆进行救命包装出活的病毒颗粒,藉此研究马感染性贫血病毒与宿主细胞之间潜在的受体彼此作用的致病机制以及疫苗保护效应的起因。此外,论文内容还将实验中片段连接的SOE-PCR技巧做了部分的拓展跟延长,通过咱们的实验改进,可能实当初单管反应中的多片段连接。盼望本文中的部分内容可能为相干研究的实验人员提供参考。二、研究方法利用SOE-PCR技巧设计重叠的互补碱基的引物实现扩增过程中的两片段延长反应,疾速的实现基因的人工合成。该技巧在多个范畴得到广泛的利用,重要包含感染性克隆的构建、病毒基因组测序、病毒的遗传变异分析、限度性片段多态性分析以及基因分型等方面。咱们在实验设计时也是基于此技巧进行的。利用SOE-PCR技巧在已有的EIAV感染性分子克隆中参加带有荧光标记物EGFP进行标记。为研究加强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因在活细胞中作为报告基因跟筛选标记的可行性,利用分子克隆技巧,将质粒pIRES2EGFP片段定点插入到EIAV感染性克隆低拷贝表白载体上,构建为重组质粒PLGgfg-3-8。GFP是一种27kDa的单体,由238个氨基酸构成,本身就是一个生物发光体系,附带有激发后能发射生物荧光的发光色基,其发光过程不同于其它生物发光组织,是不需荧光素酶参加的。GFP色基是由丝氨酸酪氨酸甘氨酸(SerTyrGly)构成的环化三肽所构成,并且只有色基包被在完全的GFP蛋白中才干发出荧光(Codyetal,1993),被堵截的GFP(即便是C末端的少数多少个氨基酸)亦能导致GFP失去发光才能。光激发GFP（略..）荧光是一个特异性的独破过程,并不须要任何的协同因子、底物或其它来自于水母的基因表白产物。当能量由Ca2+-激活光蛋白(Aequorin)传给GFP时引发荧光(Wardetal,1980)。当GFP在原核或真核细胞中表白并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。EGFP是GFP渐变系。EGFP产生了双氨基酸代替,Leu(亮氨酸)代替Phe64(苯丙氨酸),Thr(苏氨酸)代替Ser65(丝氨酸)。EGFP在488nm处激发后灯荧光强度为wtGFP的35倍。个别真核mRNA的翻译都须要5'帽子来介导核糖体结合,渺小RNA病毒家族则例外。这类病毒在其mRNA前不帽子位点,但却有600-1200bp的5’非翻译区,其中含有多个非起始AUG,这段长的非翻译区叫做内部核糖体进入位点序列(Internalribosomeentrysite,IRES)。IRES能招募核糖体对mRNA进行翻译。将IRES与外源cDNA融合,发明IRES能独破地起始翻译。在构建好带有荧光标记的感染性克隆株后,咱们进一步的采取293FT细胞进行转染包装救命使病毒恢复为存在感染力的病毒颗粒。293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系,293T以及293FT细胞由293细胞派生,同时表白SV40大T抗原,含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可能复制。用穿孔法进行转染操作可能便利的进行转染。蛋白表白程度高,转染后可能通过分析荧光表白强度可较轻易地检测到表白的蛋白。刹时转染293FT细胞是过表白蛋白并获得细胞内及细胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方法。慢病毒表白载体包含了包装、转染、牢固整合所须要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所须要的所有帮助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,须（略..）要利用表白重组后的感染性克隆载体转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心获得上清液后,可能直接用于宿主细胞的感染,目标基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高程度的表白效应分子。为后续打下基本,藉此研究病毒抗原跟受体之间彼此作用的致病机制。三、成果与论断本研究对SOE-PCR技巧进行了改进,在参加必定稀释度的旁边引物后,可能实现3个片段的直接连接。利用该技巧对已有的马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆进行EGFP分子标记,测序成果表明长度为4.2Kb的大片段其渐变的碱基数为一个碱基。在后续的对该技巧的进一步研究表明,利用该技巧可实现5片段的总长度为8Kb的大片段连接,扩大了多片段连接范畴,在国内外文献中尚无进行如此大片段多片段连接成功的报道。将构建的带EGFP分子标记的马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆进行救命,以包装出能表白EGFP的存在感染性的病毒颗粒,藉此研究马感染性贫血病毒与宿主细胞之间潜在的受体彼此作用的致病机制以及疫苗保护效应的起因。实验尚在进行中,初步实验发明,采取电穿孔的方法对293FT细胞进行质粒穿孔操作,穿孔细胞培养24小时,在荧光显微镜下察看,发明细胞可开释出了荧光,为下一步实验打下了基本。

以上为本篇毕业论文范文带有绿色荧光蛋白标记的中国马感染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的的介绍部分。

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