猪感染性胃肠炎病毒S1基因动物表白载体的构建及转化番茄的研究

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猪感染性胃肠炎病毒S1基因动物表白载体的构建及转化番茄的研究

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毕业论文范文题目：猪感染性胃肠炎病毒S1基因动物表白载体的构建及转化番茄的研究，论文范文关键词：猪感染性胃肠炎病毒S1基因动物表白载体的构建及转化番茄的研究
猪感染性胃肠炎病毒S1基因动物表白载体的构建及转化番茄的研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：猪感染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritisofswine,TGE)是由猪感染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritiscoronavirus,TGEV)引起的一种以重大腹泻、呕吐跟脱水为临床特点的高度接触性感染病,不同年纪跟品种的猪对其均易感,其中1-2周龄以下的仔猪致逝世率可达到100%,给养猪业造成极大的迫害。防备该病的有效办法是疫苗接种,传统的惯例疫苗的研制都是以大量培养病原微生物为基本,这不仅给疫苗的制造带来局限性,同时也存在潜在的不保险因素,如病原微生物灭活不彻底,导致强毒分布；弱毒疫苗存在毒力返强等问题。而利用转基因动物出产可食(饲)疫苗,存在本钱（此处忽略..）低廉,保险性好,出产速度快,接种简单以及易于运输等长处,正在引起越来越多的科学家的关注。在TGEV构造蛋白中,S蛋白是独一能在动物体内引诱产生中跟抗体的重要构造蛋白。因此,S蛋白基因是研究TGEV基因工程疫苗的重要目标基因。本研究的目标是利用RT-PCR技巧把S基因5’端包含A、D两个抗原位点的一段序列(S1)克隆入动物表白载体系统中,构建重组动物表白载体,通过农杆菌介导法转化番茄,使S1蛋白在番茄中获得表白,为研究TGEV可食性疫苗莫定基本。本研究根据GenBank数据库中的TGEV全基因序列(NC002306)设计了一对引物,针对S基因5’端A、D两个抗原位点的序列(S1),并合有XbaI跟SmaI酶切位点。用RT-PCR（文章此处忽略..）技巧从国内分别的TGEVHN-2002株中获得的PCR产物,经纯化后将其连接到pMD18-T载体上,连接产物转化E.coliDH5a,而后在氨苄抗性(Amp+)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。提取质粒经PCR,XbaI跟SmaI双酶切鉴定,成果扩增片段与预期片段大小相符；DNA序列分析成果表明,扩增的S1基因大小为912bp,完全合乎载体浏览框,与TGEVHN-2002株核苷酸序列跟氨基酸序列合乎率均为98%。将鉴定为阳性的pMD18-T／S1质粒与动物表白载体同时进行XbaI跟SmaI酶切,分辨经回收后连接。连接产物转化E.coliDH5a,而后在卡那霉素抗性(Kan+)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。提取质粒经PCR,XbaI跟SmaI双酶（文章此处忽略..）切鉴定,扩增跟酶切出的基因片段与S1基因片段大小雷同(912bp),成果表明目标基因S1成功连接到动物表白载体35SCaMV+NOS上,与预计相符,将阳性重组质粒命名为35SCaMV+NOS/S1.TGEVS1基因动物表白载体构建成功。将阳性重组质粒35SCaMV+NOS/S1经电击转化进入农杆菌AGL1中,在卡那霉素跟利福平抗性(Kan++Rif+)平板上挑取阳性菌落,28℃在5ml雷同抗性的液体培养基中培养36-48h,取出100ul菌液于50ml雷同抗性的液体培养基中培养12h至OD600=0.5-1.0。通过农杆菌介导法,将上述重悬菌液转染番茄子叶5min,转基因番茄受体经过共培养、脱菌培养、筛选培养、壮苗培养跟生根培养始终分化长出绿苗,终极获得50株抗性植株。表明该转（文章此处忽略..）基因番茄体系可在实际中操作。对抗性植株进行PCR跟RT-PCR检测,共在30株抗性植株中检测到目标基因片段(912bp),初步证明外源基因S1已经整合进番茄基因组中并转录为mRNA.对阳性转化植株进行Westernblot鉴定,成果显示在34KDa处呈现与目标蛋白分子量大小雷同的特异性条带,证明外源TGEVS1基因在番茄中成功翻译成蛋白质。本实验为TGEV转基因番茄疫苗的研究奠定了基本。

以上为本篇毕业论文范文猪感染性胃肠炎病毒S1基因动物表白载体的构建及转化番茄的研究的介绍部分。

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