猪感染性胃肠炎病毒M基因的克隆、表白及ELISA抗体检测方法的树破

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猪感染性胃肠炎病毒M基因的克隆、表白及ELISA抗体检测方法的树破

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猪感染性胃肠炎病毒M基因的克隆、表白及ELISA抗体检测方法的树破毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：猪感染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritisofpigs,TGE)是由猪感染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirusofpigs,TGEV)引起的猪的一种以呕吐、水样腹泻为重要特点的急性、高度接触性感染病。本研究根据GenBank中已经发表的TGEVM基因序列,设计合成了一对特异性引物,利用RT-PCR方法从TGEVHB06株基因组中扩增出完全的M（略..）基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中,再转化大肠杆菌DH5α感触态细胞,经PCR鉴定及酶切鉴定筛选出阳性克隆,并进行序列测序。成果表明,M基因片段大小为789bp,并且成功克隆到pMD18-T载体中。序列分析显示HB06株与GenBank中参考毒株M基因核苷酸序列同源性达94%以上,氨基酸序列同源性达92%以上,表明不同毒株M基因保守性较高。将M基因定向亚克隆入原核表白载体pGEX-6P-1,转化子经过PCR鉴定及酶切鉴定,构建了重组（略..）原核表白质粒pGEX-6P-M,而后将重组表白质粒转化到表白宿主菌Rosetta(DE3)中,用终浓度为0.7mmol/L的IPTG引诱后,经SDS-PAGE分析,成果显示重组M蛋白的分子量约为56ku,与预期融合蛋白分子量基本一致,以包涵体的情势表白,阐明重组M蛋白已在大肠杆菌中得到高效表白。Western-blotting分析表明,重组M蛋白可能被兔源抗TGEV阳性血清所辨认,证明该重组蛋白存在良好的抗原性。以纯化（本文此处忽略..）的重组M蛋白作为包被抗原,树破了检测TGEV抗体的间接ELISA方法,并断定了间接ELISA的最佳工作前提。实验成果表明,间接ELISA的阴阳性临界值为0.34,以0.7μg/mL的重组M蛋白于37°C包被1h后4°C过夜,用含5%犊牛血清的PBST于37°C封闭1h,待检血清作1?80倍、酶标二抗作1?400倍稀释后分辨于37°C反应1h跟45min后,加底物后于室温避光显色15min为最佳工作浓度跟工作前提。另外,包被的重组M蛋白与猪抗PEDV、CSFV（文章此处忽略..）、PRV、PRRSV等4种阳性血清不产生穿插反应,表明树破的ELISA诊断方法存在良好的特异性。上述研究成果表明,表白的重组M蛋白存在良好的抗原性,以其作为包被抗原树破的间接ELISA方法存在良好的特异性跟敏感性,将为我国进行TGE的免疫监测跟血清风行病学考察提供有效的技巧手段。

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