小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定

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小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定

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毕业论文范文题目：小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定，论文范文关键词：小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定
小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：传染性海绵状脑病(TSE)是一种重要的人畜共患病，羊TSE称为痒病。痒病是由于PrP~c转变成PrP~(Sc)所致。痒病免疫组化检测为目前最有效的检测方法，组织切片经蛋白酶K消化以后，PrP~c被全部消化，而PrP~(Sc)的核心片段则保留下来。由于PrP~c与PrP~(Sc)具有相同的蛋白序列，制备PrP~c核心片段的单克隆抗体，可用于痒病的免疫组化检测。因此，为研究痒病的检测方法，本实验将利用聚合酶链式反应(PCR)克隆我国绵羊朊蛋白基因，在大肠杆菌中进行原核表达。小尾寒羊外（此处忽略..）周血中分离淋巴细胞，提取基因组DNA。用PCR方法从绵羊基因组DNA中获得编码小尾寒羊朊蛋白核心蛋白片段的DNA，在其基因的5′端和3′端引入EcoRⅠ和HindⅢ位点，下游引物将原序列TATTAC突变为TAATAA产生两个终止密码子。限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切pET-32a(+)和PCR产物，然后分别用试剂盒SpinPrepGelDNAKit分别纯化。按载体与插入片段比为1：3比例混合，T4DNA连接酶连接，构建成功重组表达质粒PrP-pET-32a(+)。TSS法转化E（此处忽略..）.coliDH5a，PCR筛选鉴定阳性克隆。序列分析表明所克隆片段大小、基因插入方向和位置符合表达要求。PrP-pET-32a(+)转化E.coliBL21，首先研究了重组表达质粒PrP-pET-32a(+)在不同温度和不同培养基中的稳定性。结果表明，37℃诱导条件下，约60％E.coliBL21丢失质粒，SDS-PAGE电泳未能检测出融合蛋白Trx-PrP~c27-30的表达。25℃培养诱导条件下，90％E.coliBL21带有重组质粒PrP-pET-32a(+)，SDS-PAGE电泳检测出融合蛋白Trx-PrP~c27-（本文此处忽略..）30呈高表达。分别研究不同诱导温度、不同AMP浓度、不同时间、不同IPTG浓度和不同乳糖浓度对融合蛋白表达的影响。结果表明，随时间的增加蛋白表达逐渐增加，4h融合蛋白表达量最高可占细菌总蛋白的46.9％。IPTG浓度对Trx-PrP~c27-30表达的影响不大，0.1mM-5mM之间融合蛋白表达量相似。乳糖可使E.coliBL2的生长速度加快，小尾寒羊阮蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定浓度大于5%时融合蛋白表达量下降.丑co1，’BLZ表达菌超声波裂解后电泳，结果表明，蛋白几乎全部（此处忽略..）存在于包涵体中，超声波裂解上清和细胞周质中无融合蛋白存在.Western一Blot鉴定证明该表达融合蛋白符合预期结果，为小尾寒羊PrPc核心蛋白.本实验构建了小尾寒羊PrPc核心蛋白重组表达质粒PrP一pET一32a(+)，表达出3SKD融合蛋白，经鉴定符合预期结果.从而，为检测痒病用单克隆杭体的研制莫定了基础.

以上为本篇毕业论文范文小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定的介绍部分。

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