牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用

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牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用

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毕业论文范文题目：牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用，论文范文关键词：牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用
牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis,IBR),是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus,IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。病毒基因组编码11种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒的囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白。本试验根据GenBank公布的IBRV基因序列,以IBRVBarthaNu/67株DNA为模板,分两段PCR扩增gB基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,分别可见约1776bp(命名为gBⅠ)和1551bp(命名为gBⅡ)的特异带,将目的基因克隆到pGEM-T载体,XholⅠ和NsiⅠ双酶切,回收带粘末端的T-gBⅠ和gBⅡ,连接转化,得到gB基因的完整克隆T-gB。用生物学软（此处忽略..）件DNAstar分析gB蛋白氨基酸序列,对抗原性高、水溶性强和表面展示概率高的3个区域(分别命名为gBB,Ala_(192)-Leu_(268);gBC,Met_(308)-Leu_(402);gBD,Ala_(494)-Leu_(598))进行了原核表达。设计三对引物以构建的重组质粒为模板扩增3个目的区域,如前所述方法得到T-gBB、T-gBC和T-gBD,BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切,回收目的片段,定向克隆到同样处理的pET32a表达载体。PCR鉴定并测序确定序列正确后,三个重组表达质粒分别命名为rpET32a-gBB,rpET32a-gBC,rpET32a-gBD。将三个阳性重组质粒分别转入表达宿主菌BL_(21)(DE3)中,经终浓度为0.6mmol/LIPTG诱导,成功表达了目的蛋白,分别命名为r32a-gBB,r32a-gBC,r32a-gBD。三个重组蛋白均以（本文此处忽略..）部分可溶形式表达,重组蛋白大小与预期相符,分别为29.2KD,31.2KD和32.4KD,表达效率分别为40.9%,41.2%和61.4%。表达蛋白在非变性条件下纯化后,重组蛋白的浓度分别为2.000mg/mL,2.400mg/mL和2.000mg/mL,纯度分别为79.2%、88.2%和76.4%。经ELISA检测表明,三个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应,与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应,纯化的载体蛋白部分对阴阳性血清没有反应。r32a-gBB对牛流热(BEV)、牛肺疫(CBPP)、牛病毒性腹泻(BVD)、牛结核(BTB)、牛副结核(PBB)以及牛赤羽病(BAD)六种其它牛病种抗体阳性血清没有交叉反应,显示表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。把表达的r32a-gaB重组蛋白经初步纯化后用作包被抗原,建立了检测IBRV血清抗体的间接ELISA方法,并确定了最适（文章此处忽略..）抗原包被浓度(50μg/mL)、最适血清稀释度(1∶40)、血清最适作用时间(90min)、最适封闭液(3%明胶)、最适封闭时间(90min)、酶标抗体最适稀释度(1∶5000)、酶标二抗最适作用时间(120min)、底物最适显色时间(9min)和判定界值(0.395)。包被的重组抗原不与上述六中牛疫病阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10%,说明该方法具有很好的重复性。该诊断方法与中和试验相比较,特异性、敏感性和符合率分别为83.3%、90.9%和88.9%;与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为92%、92.7%和92.5%。应用该诊断方法检测保存的我国部分地区牛血清样品,阳性率为71.81%。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性,显示了良好的应用前景。本研究成功克隆了IBRVg（此处忽略..）B基因,对其中的三个区域进行了表达,获得了以可溶性表达的目的蛋白,为研究gB基因的功能奠定了良好的基础。利用表达的32a-gBB蛋白成功建立了快速简便的ELISA诊断方法,为开发商品化试剂盒、IBR的流行病学调查及其控制消灭提供了坚强的技术支持。

以上为本篇毕业论文范文牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用的介绍部分。

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