猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的分子检测方法研究

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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的分子检测方法研究

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毕业论文范文题目：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的分子检测方法研究，论文范文关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的分子检测方法研究
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的分子检测方法研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：根据GenBank上公布的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型和血清3型ApxⅣA基因全序列,设计了7对引物,对血清5型ApxⅣA基因全序列进行了分段PCR方法扩增和克隆。序列测定结果表明:APP血清5型ApxⅣA基因全序列全长5856bp,比GenBank上公布的血清1型和3型相应基因全序列分别长438bp和1287bp,与其同源率分别为95.5%和95.4%;与公布的血清5型的氨基酸序列的同源性为98.1%。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲（略..）水性,存在一个很明显的跨膜区,共有55个抗原决定簇,在整个序列的N段序列存在较强的抗原性。对APP血清5型ApxⅣA基因的氨基酸序列进行了二级结构、疏水性、抗原决定簇以及跨膜区的分析,选择抗原性较强的N端区域的部分基因进行原核表达。通过PCR扩增出了ApxⅣA,并将其克隆到PMD-18T载体上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定之后,将ApxⅣA基因正确插入原核表达载体PET32a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点间,（此处忽略..）成功构建了重组表达质粒PET32atApxⅣA,重组表达质粒PET32atApxⅣA转化表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达出大小为62KD的APP重组蛋白。对重组蛋白进行了可溶性与不可溶性分析,结果表明表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在。同时对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度进行了优化,确定了最佳表达条件。以纯化的重组蛋白为包被抗原(重组蛋白量为0.28mg/ml),建立了检测APP-5型感染的间接ELISA方（文章此处忽略..）法;结果表明当OD_(450)≥0.31时即判定为阳性,当OD_(450)＜0.31时即判定为阴性。且该方法能特异性地区别临床上的猪蓝耳病、猪链球菌、猪瘟、猪巴氏杆菌。表明该方法可以作为住传染性胸膜肺炎的临床诊断和检测。设计和合成一对检测APP的引物,建立了APP的核酸检测方法。特异性试验表明,该方法对APP的特异性好,不与猪巴氏杆菌,猪链球菌,猪大肠杆菌,猪沙门氏菌,绿脓杆菌反应;敏感性试验表明检测细菌的最低浓度为2500个/ml;（略..）以小鼠为实验动物建立APP感染模型,组织病料的检测结果表明病料直接检测或培养2h后各组织器官均不能扩增出APP特异条带,病料培养4h后,只有肝和肾组织能扩增出微弱的特异性条带,病料培养6h后从心、肝、脾、肺、肾中均可扩增出APP特异条带。

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