小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及活动皮层中的变更

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小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及活动皮层中的变更

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毕业论文范文题目：小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及活动皮层中的变更，论文范文关键词：小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及活动皮层中的变更
小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及活动皮层中的变更毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标:肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是一种致逝世性神经体系变性疾病,表示为进行性肌肉萎缩、肌无力跟锥体束征。患者多在首次呈现症状后的3-5年内因球麻痹、呼吸衰竭或肺部感染而逝世亡。病理上以抉择性上或/跟下活动神经元丧失为特点,伴有小胶质细胞及星形胶质细胞活化。约5-10%为家族性ALS(familialALS,fALS),90-95%是披发性ALS(sporadicALS,sALS)。fALS跟sALS的临床表示很类似,大概20%fALS病例及4%sALS病例与铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase1,SOD1)有关,其中以G93A位点渐变最常见,即在基因密码子第93位点甘氨酸代替丙氨酸。SOD1-G93A转基因小鼠表示为进行性活动神经元变性,与人类ALS类似,是世界上研究ALS的公认动物模型。用人SOD1(humanSOD,hSOD1)转基因鼠进行体内跟体外研究,发明人渐变SOD1(humanmutantSOD1,hmSOD1)通过以下道路使活动神经元受损,包含:异样蛋白质凑集、线粒体功能失调、氧化应激、细胞骨架异样、轴浆运输受损、谷氨酸高兴毒性、成长因子缺乏及神经炎症等。神经炎症是指一种细胞跟分子过程,包含小胶质细胞跟星形胶质细胞的活化及四周免疫细胞的浸润,在中枢神经体系(centralnervoussystem,CNS)的多种病理前提下会产生,包含神经变性疾病如ALS等。神经炎症是ALS病人及hmSOD1模型小鼠的病理学特点,而神经胶质增生是神经变性疾病中神经炎症的独特特点。在ALS神经炎症部位,重要有星形胶质细胞、小胶质细胞及少量的T-淋巴细胞。大量证据表明,炎症在ALS中起关键作用,然而小胶质细胞-神经元彼此作用导致活动神经元病的本质仍然不明。目前广泛研究的是小胶质细胞（文章此处忽略..）慢性、有害的神经炎症引起神经元变性。本实验用世界上广泛研究的ALS动物模型SOD1-G93A小鼠作为研究对象,利用免疫组织化学及激光共聚焦方法研究转基因小鼠疾病不同时代活动皮层及腰髓小胶质细胞状况及数量变更,利用免疫印迹法研究小胶质细胞特异性标记物随病程的表白变更,探讨小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠疾病过程中的变更法则,分析其活动神经元逝世亡中的可能作用,为ALS医治提供潜在靶点。方法:1转基因鼠的繁殖所有转基因鼠均豢养在恒温(25-27℃)、恒湿、无特定病原菌(specificpathogenfree,SPF)环境中,以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料、无菌水进行豢养,每个鼠笼随机豢养3-5只小鼠。动物实验过程按照河北省实验动物管理办法规定。为保持B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur转基因小鼠渐变基因牢固下传,将B6SJLSOD1-G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖,两种小鼠均购自美国Jackson实验室(BarHarbor,ME,USA),最初由Gurney等研制。子代鼠尾部组织在三周左右经PCR基因扩增鉴定,断定是否带有hSOD1基因。2活动功能评分及实验分组2.1活动功能评分活动功能评分从小鼠50天开端每天评分一次。采取4分评分体系。(1)4分畸形,无活动妨碍;(2)3分悬尾时后肢震颤;(3)2分步态异样;(4)1分至少一侧后肢拖拽;(5)0分将小鼠仰或侧卧,30秒内不能翻正。2.2实验分组根据SOD1-G93A小鼠的发病法则分为症状前期(60天)、症状早期(100-120天)跟终末期(130-150天)3个时光点取材。每个时光点设有模型组、同窝对比组。模型组为SOD1-G93A转基因小鼠,对比组为非转基因同窝对比小鼠,每组每个时光点6只小鼠,均为雌性。症状前期组取自出生后60天,体重无减轻且无临床症状,评分4分。症状期指体重开端减轻、呈现步态异样,评分2分。终末期以SOD1-G93A小鼠体重减轻20%,仰卧30秒不能翻身为准（本文此处忽略..）,评分0分。3实验方法3.1取材实验期间每天察看动物、评分及称重。在SOD1-G93A小鼠症状前期(60天)、症状早期(100-120天)跟终末期(130-150天)时取材,同窝对比小鼠在相应时光点取材。用10%的水合氯醛(350mg/Kg)腹膜内打针麻醉后,分辨以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓或活动皮层组织敏捷投入液氮速冻后于-80℃冰箱保存。3.2免疫印迹(Westernblotting)分辨取10mg腰髓及活动皮层组织按试剂盒阐明提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度。每个样品按30μg蛋白上样,10%SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜,室温脱脂奶粉(PBS稀释)封闭1小时后,分辨加兔抗CD11b抗体(1:200)、鼠抗GAPDH抗体(1:200)及羊抗SOD1抗体(1:200),4℃摇床过夜。次日,TPBS洗膜5次,每次5分钟。而后分辨参加抗兔、抗小鼠跟抗羊荧光二抗(1:3000)室温孵育1小时,TPBS洗膜4次,PBS洗膜1次,每次均为5分钟,Odyssey红外扫描成像体系(美国LI-COR公司)扫膜并分析成果。打算目标条带与GAPDH的灰度比值并进行统计学处理。3.3免疫组织化学法脊髓及活动皮层组织经4%多聚甲醛固定后,LeicaVT1000S振动切片机切成20μm切片,0.01MPBS溶液漂洗5分钟×3次;3%H2O2浸泡15分钟以封闭组织内源性过氧化物酶;0.01MPBS漂洗5分钟×3次后,0.3%tritonX-100穿孔15分钟。10%马血清室温封闭1小时后,参加兔抗Iba1抗体(1:200)4°C过夜;0.01MPBS洗5分钟×3次后,加生物素化二抗(山羊抗兔IgG)室温2小时;0.01MPBS洗5分钟×3次;加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温1小时;0.01MPBS洗5分钟×3次,DAB染色10分钟,捞片,脱水,透明及封片。3.4共聚焦显微镜法腰髓组织经4%多聚甲醛固定后,继而用30%蔗糖/4%多聚甲醛溶液浸泡12小时至组织沉底,以保护组织免受冰冻伤害。冷冻包埋剂OCT包埋后,经LeicaCM1850冷冻并切成30μm切片,与免疫组化方法类似,经漂洗、穿孔、封闭及抗Iba1抗体孵育后,（本文此处忽略..）FITC标记羊抗兔二抗室温孵育1小时,PBS漂洗后,抗荧光衰减封片剂封片,OlympusFV1000察看及摄影。3.5小胶质细胞计数采取Nikon50i科研级显微镜。每个时代3只小鼠,每只小鼠随机取5个视线,400×放大倍数下分辨计数SOD1-G93A转基因小鼠症状前期、症状早期及终末期腰髓前角及活动皮层有完全胞体的Iba1阳性小胶质细胞数量,并与非转基因对比小鼠比拟较。3.6统计学分析实验成果以均数±标准差表示,采取SPSS13.0.4软件,统计方法为多样本参数方差分析。P0.05有统计学意思。成果:1转基因鼠的鉴定子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示:位于300-400bp之间的条带(324bp),为内参照IL-2的PCR产物;位于200-300bp之间的条带(236bp),为人SOD1基因的PCR产物。2临床表示在60天及以前,SOD1-G93A小鼠无明显临床变更,评分4分。80-90天左右,悬尾实验时小鼠开端呈现双后肢震颤,评分3分。在100-120天左右SOD1-G93A小鼠逐步呈现一侧或双侧后肢明显无力、肌肉萎缩及步态异样,评分2分。之后,双后肢进行性肌肉萎缩,不能支撑身材,进而至少一侧后肢完全瘫痪,行走时拖拽,评分1分。约在130-150天左右,将其仰卧后30秒内小鼠不能自行翻转,体重降落超过20%,达到终末期,评分0分。而同窝对比组小鼠无上述表示,评分始终为4分。3小胶质细胞变更3.1通过免疫印记法察看小胶质细胞特异性标记物CD11b表白量,发明同窝对比组小鼠腰髓表白量很少,且在60天至150天之间,随年纪增加其表白无明显差别(P0.05)。在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓,症状前期表白即有所增多,症状早期明显升高,终末期达顶峰(P0.05)。而在SOD1-G93A转基因小鼠活动皮层,CD11b表白与同窝对比组比拟无明显差别(P0.05)。3.2通过小胶质细胞特异性标记物Iba1免疫组化染色,发明同窝对比组腰髓前角Iba1阳性小胶质细胞数量较少,胞体小且崛起少,且在150天龄之前,随年纪变更其数量无明（文章此处忽略..）显差别。在SOD1-G93A转基因小鼠症状前期,Iba1阳性小胶质细胞数量轻度增多,症状早期明显增多,胞体增大,崛起增粗,终末期更著。而在症状早期及终末期的脊髓后角,Iba1阳性小胶质细胞数量也存在轻度增生,但程度远不迭前角。在活动皮层,SOD1-G93A转基因小鼠与同窝对比组比拟Iba1阳性细胞数量无明显差别。论断:SOD1-G93A转基因小鼠疾病进展过程中存在小胶质细胞增生,且早在症状前期已经产生,症状早期增生明显,终末期达顶峰。小胶质细胞增生的部位与疾病受损部位一致,且增生程度与病变重大程度成正比。SOD1-G93A转基因小鼠腰髓小胶质细胞的活化可能参加活动神经元的伤害过程。

以上为本篇毕业论文范文小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及活动皮层中的变更的介绍部分。

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