结核分枝杆菌保护性抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备

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结核分枝杆菌保护性抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备

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毕业论文范文题目：结核分枝杆菌保护性抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备，论文范文关键词：结核分枝杆菌保护性抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备
结核分枝杆菌保护性抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)所致的、以呼吸系统感染为主的慢性传染病。全球目前约有20亿人感染了MTB,每年死于TB的人数高达200万。TB已成为人类的头号传染病杀手。我国目前至少有5亿人感染了MTB,每年死于TB的人数约有25万,是我国其他传染病和寄生虫病死亡人数总和的两倍多。卡介苗(BacilleCalmette-Guerin,BCG)接种目前仍然是预防TB的主要手段,但总体保护率不稳定,介于0%-80%。TB目前仍没有十分有效的早期诊断方法。随着MTB耐药株的出现与人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficienc（此处忽略..）yvirusHIV)合并感染及人口流动增加等因素的出现,进一步加剧了TB对人类的威胁。因此,积极研究MTB致病机制及免疫机制,研制更加有效的诊断及治疗MTB感染的新方法、新技术、新疫苗就具有重大意义。分泌蛋白是MTB在对数生长早期分泌到菌体外的一类蛋白,也是目前确认的MTB蛋白中能够诱发保护性免疫的一类蛋白,Ag85B和ESAT6是其中重要的组成成分,广泛用于治疗TB的预防和诊断研究中。复活促进因子(Resuscitationpromotingfactor,RPF)最早是在藤黄微球菌(Micrococcusluteus)中发现的,它可以促进休眠期MTB的生长。RPFD以分泌形式表达,抗原性较（此处忽略..）强,因此,RPFD在TB的疫苗研制和快速诊断试剂方面有较大的应用潜力。实验目的:构建表达MTBH37RV保护性抗原Ag85B、Ag85B-ESAT6和ESAT6-RPFD的原核表达载体,表达并纯化三种蛋白,并制备抗Ag85B蛋白的单克隆抗体(mAb)。实验方法和结果:1.以MTBH37RV株基因组为模版,采用PCR方法分别扩增ag85B,esat6,rpfD基因,经测序证实与Genebank公布的序列完全一致。将目的基因片段亚克隆入pProEXHTb原核表达载体,酶切鉴定阳性重组质粒pPro-ag85B、pPro-ag85B-esat6和pPro-esat6-rpfD。用IPTG诱导表达Ag85B、Ag85B-ESAT6和ESAT6-（本文此处忽略..）RPFD三种蛋白。SDS-PAGE分析和WesternBlot表明,成功地表达了Ag85B、Ag85B-ESAT6和ESAT6-RPFD蛋白。相对分子量分别为32kD,43kD和30kD,与预计蛋白大小相符。用Ni-NTA亲和色谱柱变性条件下纯化获得三种重组蛋白,200mL培养物可分别获得25.52mg、17.16mg和23.76mg的纯化蛋白,得率分别为4.4%、3%和4.1%。2.取纯化的Ag85B蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合,乳化。6周龄雌性BAL/c小鼠100μg/只背部皮下多点注射。间隔2周,共免疫三次。末次免疫两周后,选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫50μg/只。3天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合,加入铺有饲养细胞的96孔板。用HAT培养液培养1周（此处忽略..）左右,换成HT培养液用以筛选阳性融合细胞。获得杂交瘤细胞系1C11,2D5,3H3。经测定,这三株杂交瘤细胞系均为IgG1亚类。取效价最高的1C11杂交瘤细胞系注射BAL/c小鼠腹腔,抽取腹水,用硫酸铵法纯化腹水。采用WesternBlot、间接免疫荧光法和ELISA法测定mAb为抗Ag85B的单克隆抗体,特异性检测显示mAb可与MTB发生特异性反应。

以上为本篇毕业论文范文结核分枝杆菌保护性抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备的介绍部分。

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