MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究

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MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究

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毕业论文范文题目：MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究，论文范文关键词：MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究
MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：猪瘟又称经典猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF),是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。本研究建立了CSFV野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株(HogCholeraLapinizedVirus,HCLV)的鉴别检测方法,并完成了试剂盒的初步组装。同时以猪的看家基因β-actin(ACTB)作为内参,建立了CSFV核酸的相对定量PCR方法,并采用该方法分析了CSFV石门株(SM)急性感染后的复制规律、动态分布规律和组织嗜性规律。为了从定量的角度探讨CSFV急性感染后病毒的复制规律、动态分布规律和组织嗜性规律,同时为CSFV鉴别检测提供可靠的技术支持。本研究将荧光定量PCR(FQ-PCR)技术和ABI7500定量检测系统相结合,对GenBank公布的CSFV全序列、牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)全序列和绵羊边界病病毒(BDV)全序列进行综合比对,设计了一套针对CSFV野毒株的特异TaqMan-MG（略..）B荧光探针和引物;同时,针对猪看家基因ACTB序列,设计了另一套特异性引物和探针作为内参。经过体系和反应条件优化,建立了一套相对定量CSFV核酸的FQ-PCR方法,CSFV和ACTBRNA扩增效率分别为91.7%和92.4%,CT值与模板起始浓度对数之间的线性关系良好,相关系数均为0.998。实验结果证实,该方法对BVDV、PRRSV、FMDV等9种猪相关病原核酸扩增阴性,显示良好的特异性,同时对5厂家6批次HCLV疫苗核酸扩增为阴性,避免了HCLV对实验的干扰,因此,该方法能鉴别检测CSFV野毒株和HCLV株;该方法灵敏度比本实验室建立的RT-nPCR高1个数量级,检测极限达5.3×10~(-2)pg病毒核酸;30个质控样本在5个月内的CT值变异系数为1.70～7.66%,均小于10%,说明该CSFVTaqMan-MGBPCR方法具有很好的稳定性;对122份临床疑似CSF的样本检测结果证实,该方法与RT-nPCR的符合率为94.3%。同时我们用CSFVTaqMan-MGBPCR方法和猪瘟免疫荧光方法(HCFA)对北京某（此处忽略..）猪场800多份扁桃体样本进行检测,结果证实两种方法具有较高的符合率。采用4×10~(3.84)TCID_(50)SM血毒1ml,肌肉注射感染16头60日龄长白猪,同时设立1头阴性对照。感染全程进行体温监测和临床症状计分,感染后每天随机剖杀2头,采集体内各主要淋巴结、扁桃体、脾脏、肾脏、肠道、心肌、脑组织等共22种组织、器官,并采用2-CT方法进行CSFVRNA的FQ-PCR定量检测,定量指标为相对感染密度,即单位细胞内感染病毒的核酸含量。定量检测结果显示:1.CSFVSM血毒感染24h后,感染猪22种组织、器官均能检测出CSFV核酸;2.从感染后第1天到濒死前第8天,22种组织、器官的CSFV感染密度均呈总体上升趋势。与第1天比,回肠、肝脏和颌下淋巴结第8天的感染密度分别上升5.997、5.649和5.175个数量级,上升最快。上升最慢的为肾脏和肌肉,增幅分别为1.432和0.797个数量级;3.CSFV在胰腺、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、回肠、颌下淋巴结、脾脏、空肠、皮肤、肺、肝脏、扁桃体、直肠、回盲瓣、肾脏、脊髓、食道、膀胱、胃、十二指肠、肌（此处忽略..）肉、脑组织和心肌中的相对感染密度分别为5.069、5.053、4.964、4.925、4.843、4.792、4.514、4.076、4.034、3.989、3.919、3.830、3.711、3.580、3.555、3.188、2.935、2.883、2.768、2.641、2.590和2.185个数量级。阴性对照猪上述组织、器官均未检出CSFV核酸。体温监测和临床症状计分结果显示:SM血毒感染后,从第2天开始,少数出现食欲下降、精神萎顿、体温升高,其后体温逐渐上升,此间临床症状计分迅速增加,伴随体温升至41℃左右,稽留36-48h,其间食欲下降至废厥,精神萎靡、站立不稳,此后体温开始回落;至频死前第7-8天,临床症状计分达最高值22-24,感染猪出现呼吸急促、消瘦、倒地、抽搐;耳、鼻、四肢、腹部皮肤潮红、瘀斑;至频死期时体温回落至39.5-40℃。整个病程的加重程度与病毒载量的增加呈正相关。阴性对照猪体温维持在39.5℃左右,无CSF临床症状。免疫组化检测结果显示,CSFV抗原信号在感染后24h即可在被检22种组织、器官中检测到,初期阳性信号主要集中于毛细血管内,其后逐渐弥散到毛细血管外,进入外周组织细胞内,在胞内出现阳性信号,且信号呈现增强趋势。阴（此处忽略..）性对照猪试验期间呈健康状态,未见阳性信号。采用TaqMan-MGB荧光RT-PCR方法全面系统地对人工急性感染后的试验猪进行了繁殖动态与组织嗜性的研究,其研究结果与感染后的致病特征与临床症状和免疫组化相符合。本研究建立的CSFV鉴别检测方法为CSF的净化提供了可靠的技术支撑;同时将其应用于CSFV的繁殖动态和组织嗜性研究,为弄清CSFV的病原特性,致病机理奠定了基础。

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