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人神经养分因子-3基因的亚克隆及其基因工程细胞模型的树破

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毕业论文范文题目:人神经养分因子-3基因的亚克隆及其基因工程细胞模型的树破,论文范文关键词:人神经养分因子-3基因的亚克隆及其基因工程细胞模型的树破
人神经养分因子-3基因的亚克隆及其基因工程细胞模型的树破毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:感音神经性聋的病理改变重要是毛细胞、螺旋神经节、支撑细胞及神经未梢的器质性改变。毛细胞在体内、体外因为强声、耳毒性药物、老年化、外伤跟各种疾病等造成的伤害,是感音神经性聋跟均衡妨碍的重要病理基本。近年的研究表明非哺乳脊椎动物、哺乳动物前庭毛细胞伤害跟非哺乳脊椎动物耳蜗毛细胞伤害后,在解剖跟功能上有明显的自我修复才能,然而到目前为止,哺乳动物包含人的耳蜗毛细胞再生研究尚无冲破性进展。感音神经性聋的医治是临床亟待解决的问题。干细胞是一类无穷期、在机体的全部生命期中有自我更新才能的细胞。在合适的前提下或给予合适的信号,干细胞可能生成(分化)构建身材的很多不同细胞,即干细胞有潜力发展成存在特点性状况跟特别功能的成熟细胞,如心肌细胞、皮肤细胞跟神经细胞等。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)是位于骨髓基质中的成体干细胞,有学者发明在特定前提下BM-MSCs可能生成多种细胞,如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、上皮细胞、神经元跟神经胶质细胞等。神经养分因子(Neurotrophin)是一组与神经构造跟功能密切相干的蛋白家族(略..),它包含神经成长因子(NGF)、脑源性神经养分因子(BDNF)、胶质细胞源性神经养分因子(GDNF)、神经养分因子-3(NT3)、神经养分因子4/5(NT4/5)以及最近发明的NT6,是外周跟中枢神经体系中最重要的内源性蛋白,调控着神经元的成长、分化跟生存,对保持神经体系的畸形功能承担侧重要作用。其中BDNF跟NT3是内耳发育最基本养分因子,而且对保持成年耳蜗功能亦有重要的作用。前者的作用侧重于前庭,后者侧重于耳蜗。本实验利用细胞培养技巧,体外分别、培养、扩增人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),鉴定其生物学特点;以脂质体介导方法,将人神经养分因子一3基因导入BM一MSCs,构建BM一MSCS基因工程细胞模型;PCR检测NT3体表面白,并察看其细胞培养上清液体外促进豚鼠耳蜗毛细胞的存活作用。方法:(l)细胞培养:利用细胞培养技巧,体外分别、培养、扩增人骨髓间充质干细胞(BM一MSCs),光学显微镜下动态察看细胞状况,成长特点。(2)BM一MSC名义标记的检测:把将近融合的第3代BM一MSCs用0.25%胰酶消化,离心,PBS洗涤,制备成1x106/mL的细胞悬液,用流式细胞仪检测其名义标记。(3)四氮哇蓝盐(此处忽略..)法绘制生存曲线:第3、6、9代BM一MSCs制成单细胞悬液,用Bio1Rad酶联免疫检测仪检测各孔0D值(入=570nm),绘制成长曲线。(4)pEGFP一Nl转染BM一MSCs:用脂质体介导的方法,以pEGFP一Nl转染第4代跟第7代BM一MSCs,计数其转染率。(5)真核表白载体peDNA3.1(+)/NT3的构建:以Hindlll、EeoRI双酶切pUC18/NT3跟peDNA3.1(+)质粒,回收NT3跟peDNA3.l(+)大片段,用T4DNA连接酶连接。(6)目标基因转染BM一MSCs跟牢固克隆的筛选:以脂质体介导,用pcDNA3.1(+)/NT3跟peDNA3.1(+)质粒转染BM一MSCS,37亡、5%C02前提下持续培养48h。以含300pg/m1G418筛选三周,有克隆构成,再以含200pgG418/m1保持并扩大培养。(7)离体孵育豚鼠耳蜗毛细胞:活杀豚鼠后取出两侧颖骨,将基底膜从蜗轴分别,置于Hanks培养液中。实验组加Hanks液跟转染peDNA3.1(+)/NT3的BM一MSCS培养上清液,对比组加Hanks液跟转染poDNA3.1(+)的BM一MSCS培养上清液,37七、5%COZ前提下孵育4小时,察看毛细胞成长情况。成果:(1)骨髓单个核细胞第0天呈体积较大的圆形细胞,接(文章此处忽略..)种后24h内单个核细胞实现贴壁。培养3d,去除未贴壁细胞,可见单个核细胞呈梭形,有些细胞呈三角形或多角形。15一ZOd,细胞基本融合成单层,细胞呈梭形,排列明显有方向性,呈漩涡状排列,细胞状况、大小基本一致。(2)察看第3,6,9代BM一MSCs成长曲线,可见经过一两天的埋伏期,细胞进入疾速增加期,持续3一5d,进入迟缓增加期。(3)经流式细胞仪检测,BM一MSCs表白CD13,CD29,CD59,不表白CDll,CD14,CD31,CD34,CD38,CD45,CD80,CD86,CDll7,HL舟DR,表明其不同于造血干细胞。(4)Hindlll、EeoRI内切酶双酶切peDNA3.1(+)/NT3,109/L琼脂糖凝胶电泳,呈现774bp跟5.4kb片段,提交测序后与GeneBank中提供的序列完全一致。(5)NT3基因工程细胞的鉴定:转染了pcDNA3.l(+)/NT3的BM一MSCS跟空载体peDNA3.1(+)的BM一MSCs,提取其总RNA,109/L琼脂糖凝胶电泳不差别。RT一PCR产物以109/L琼脂糖凝胶电泳,实验组察看到约774bp跟580bp特异性条带,而对比组仅有580bp的特异性条带,其地位与预期的NT3跟GAPDHcDNA的长度相符。(7)基因工程细胞的生物学鉴(本文此处忽略..)定:用转染了pcDNA3.1(+)/NT3的BM一MSCS培养上清液跟转染了空载体pCDNA3.l(+)的BM一MSCs培养上清液体外孵育的豚鼠毛细胞,可察看到前者孵育的毛细胞小部分倒伏,后者孵育的毛细胞大部分倒伏,狼藉,甚至片状消散。论断:(l)采取本实验培养细胞的方法体外分别、培养、扩增人BM一MSCs是可行的。可能获得大量的高度均一的BM一MSCs,而且数次传代后其干细胞的生物学特点不变。(2)以骨髓间充质干细胞为转染对象,树破可能表白NT3的基因工程细胞模型,岂但可能表白、分


以上为本篇毕业论文范文人神经养分因子-3基因的亚克隆及其基因工程细胞模型的树破的介绍部分。
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