鼠疫菌重要调控蛋白的表白纯化及其DNA结合活性分析

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鼠疫菌重要调控蛋白的表白纯化及其DNA结合活性分析

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毕业论文范文题目：鼠疫菌重要调控蛋白的表白纯化及其DNA结合活性分析，论文范文关键词：鼠疫菌重要调控蛋白的表白纯化及其DNA结合活性分析
鼠疫菌重要调控蛋白的表白纯化及其DNA结合活性分析毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：鼠疫是一种天然疫源性疾病,鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是其病原菌。鼠疫菌在蚤体跟宿主动物之间轮回的过程中,受到多种刺激因素(如pH、浸透压、过氧化物、温度等)的刺激,鼠疫菌能感应这种刺激并做出应答,终极使鼠疫菌得以存活并对宿主致病。鼠疫菌对宿主致病的过程,就是其在宿主体内大量繁殖并对宿主产生毒力的过程,从分子程度上看,这是一个有复杂细胞道路构成的周到调控的过程。其中,鼠疫菌内存在的各种调控子(如PhoP、RovA、H-NS、Fis、CRP等)感应刺激信号,在转录程度上对靶基因的上和谐下调,起着关键的作用。目标:本实验利用大肠杆菌BL21λDE3的表白体系,异源表白8个与鼠疫菌传播及致病密切相干的调控子蛋白:PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur跟OmpR。并对这些蛋白与DNA的结（此处忽略..）合活性进行分析,为构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络树破分子生化实验平台。方法:利用生物学软件设计鼠疫菌调控子蛋白基因phoP、oxyR、rcsB、rovA、hns、crp、fur、ompR的ORF区的高低游引物,并PCR扩增,纯化后通过酶切连接等分子克隆技巧,分辨将它们的ORF区直接克隆入pET28a质粒中,而后再将重组质粒转入大肠杆菌BL21菌株中,通过筛选鉴定构建出鼠疫菌调控子蛋白的表白菌株;所得菌株经IPTG引诱后能分辨表白带His标签的鼠疫菌PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur跟OmpR融合蛋白,利用Ni-NTA柱结合融合蛋白,经洗涤、洗脱、稀释等步骤进一步纯化这些融合蛋白。利用生物信息学方法,对上述调控子蛋白与DNA的结合序列进行猜测,筛选可能的靶基因,并通过体（文章此处忽略..）外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证上述蛋白与靶DNA的结合活性。EMSA实验是利用核酸与蛋白结合后,分子量变大,在其它前提一致的情况下,电泳迁徙率变慢的原理来验证蛋白是否与特定核酸结合。筛选H-NS重组蛋白,利用DnaseI脚印实验,研究其对靶基因结合位点的特点,分析结合序列的GC含量,进一步验证所表白蛋白的正确性。DNaseⅠ脚印实验的原理是利用DNaseⅠ随机消化DNA序列,而被蛋白结合的序列免于消化,从而在聚丙烯酰胺凝胶上呈现空白区域(即“脚印”),如若配伍测序带就能直接读出空白区域所对应的碱基序列。成果:成功的表白出有活性的鼠疫菌PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur跟OmpR调控子融合蛋白,这些蛋白与靶基因启动子区存在体外结合活性。EMSA成果表明:PhoP、Ox（文章此处忽略..）yR、RcsB、RovA、CRP、Fur跟OmpR能分辨特异性结合到YPO0736,hmsT、waaA、psaE、ompC、yfeA跟ompF的启动子区,不仅阐明所表白的融合蛋白是有活性的,也反应出鼠疫菌上述调控子对其能结合的靶基因存在直接的调控作用。对H-NS蛋白,抉择了pla跟pst这2个靶基因去研究,EMSA成果表明H-NS能直接作用于这两个基因的启动子区,表示H-NS能直接调控它们的表白;而DNaseⅠ脚印实验成果更进一步证明了这个成果。对H-NS结合位点的碱基GC含量分析发明,被结合的地位都是低GC(含量不足30%)含量的地位,这跟H-NS对高AT含量的DNA序列存在结合偏好的特点相合乎,阐明所表白纯化的H-NS融合蛋白是完全正确,且是有活性的。论断:成功表白了鼠疫菌的8种调控子融合蛋白,即PhoP、（略..）OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur跟OmpR,它们分辨对YPO0736,hmsT,waaA,psaE,pla(还有pst),ompC,yfeA跟ompF存在良好的结配合用;H-NS对靶基因pla跟pst的结合序列的碱基组成特点跟实际一致,进一步阐明利用大肠杆菌所表白的H-NS融合蛋白是完全成功的。意思:通过本课题的研究,构建出8个有活性的鼠疫菌关键调控子蛋白,这是转录调控研究时体外实验的基本;而EMSA跟DNaseⅠ脚印实验平台的树破与完美,也为后续的鼠疫菌转录调控研究奠定了必定的基本;有了上述2个基本,就为鼠疫菌毒力基因转录调控网络的构建打下了一个坚实的基本,对鼠疫的医治以及疫苗抗原蛋白的筛选都有必定的意思。

以上为本篇毕业论文范文鼠疫菌重要调控蛋白的表白纯化及其DNA结合活性分析的介绍部分。

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