黄芩苷对高脂血症及脂多糖诱导的NF-κB信号通路的影响

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黄芩苷对高脂血症及脂多糖诱导的NF-κB信号通路的影响

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毕业论文范文题目：黄芩苷对高脂血症及脂多糖诱导的NF-κB信号通路的影响，论文范文关键词：黄芩苷对高脂血症及脂多糖诱导的NF-κB信号通路的影响
黄芩苷对高脂血症及脂多糖诱导的NF-κB信号通路的影响毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：实验目的炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应,炎症反应在很多疾病的病理过程中起着重要作用。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是危害人类健康的主要疾病之一,目前认为AS是具有慢性炎症反应特征的病理过程,其发展始终伴随炎症,慢性炎症介导其发生、发展的全过程。AS是多种心脑血管疾病的病理基础,加强对AS的病因、发病机制和防治的研究,对于延迟和逆转AS病变的进展,降低心脑血管疾病的发病率和病死率,具有很重要的意义。近年来,革兰阴性菌的细胞壁重要成分——脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)与AS形成的关系成为研究的热点。多种炎性细胞和细胞因子参与了AS的进程,巨噬细胞作为AS斑块中的主要炎症细胞,可通过NF-κB途径产生多种炎症介质及炎症因子,促进AS斑块的形成和发展。本课题组在前期研究中证实了黄芩苷的抗AS效应,但对其作用机制并不完全清楚。本研究旨在探讨：(1)黄芩苷对NF-κB信号通路的调控作用；(2)黄芩苷对高脂血症小鼠血脂紊乱的干预作用。实验方法本研究分为体内和体外实验两部分：1.体内实验。C57BL/6小鼠高脂血症动物模型的建立及黄芩苷的干预作用主要为以下实验：(1)C57BL/6小鼠用LPS腹腔注射联合高脂饮食建立高脂血症动物模型用LPS腹腔注射联合高脂饮食建立小鼠高脂血症动物模型,具体方法如下：C57BL/6小鼠分笼适应性饲养3天后,随机分为5组,每组13只小鼠,分为五组：空白对照组、单纯高脂组、高脂+LPS组、黄芩苷高剂量组(高脂+LPS)、黄芩苷低剂量组(高脂+LPS)。空白对照组给予正常饮食喂养,其余各组均给予高脂饮食,正常饮水。3周后除空白组和单纯高脂组以外,其余腹腔注射LPS30μg/只,每周注射1次,共6次。LPS注射第3次后,高、低浓度黄芩苷治疗组开始每天给予黄芩苷腹腔注射,连续治疗7周。(2)动物给予药物黄芩苷治疗7周后,禁食12小时,摘眼球取血,分离血清,采用（文章此处忽略..）酶法分析检测动物的血脂水平,包括总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL),评价黄芩苷防治对血清中血脂含量的影响。2.体外实验。探寻黄芩苷对NF-κB信号通路的调控作用,主要包括：(1)小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的培养将RAW264.7细胞在25cm2的培养瓶内,用DMEM培养基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)5%C02,37℃条件下培养,当长至80%融合时,用含胰蛋白酶-EDTA消化,传代。(2)黄芩苷对RAW264.7肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6生成的影响取生长状态良好的细胞用0.25%胰酶消化,台盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%,用DMEM培养基调整细胞浓度为1×106/m1,每孔lml接种到24孔培养板内,待细胞生长至80%融合后,加入不同浓度的黄芩苷(终浓度分别为10,50,100μmol/L)孵育1h,然后加入LPS(终浓度1μg/mL)进行刺激。实验分组如下：正常对照组、黄芩苷组、LPS组和黄芩苷加LPS组。RAW264.7细胞加入黄芩苷和LPS后继续培养18h,收集各处理组细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附法,用TNF-α和IL-6Elisa试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。酶标仪在波长570nm处测OD值。(3)黄芩苷对TNF-α、IL-6mRNA表达的影响①取对数生长期的细胞以1×106/m的浓度接种于24孔培养板内,待细胞生长至80%融合后,加入不同浓度的黄芩苷(终浓度分别为10,50,100μmol/L)孵育1h,然后加入LPS(终浓度1μg/mL)进行刺激。实验分组如下：正常对照组、黄芩苷组、LPS组和黄芩苷加LPS组；培养6h后,用Trizol法提取细胞总RNA。②逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-α、IL-6mRNA的表达以总RNA为模板,以Oligo-d(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA,用特异性引物分别扩增TNF-α、IL-6和β-Actin。TNF-a引物序列如下,Sense:5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3',Antisense:5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3';IL-6引物（本文此处忽略..）序列如下,Sense:5'-TTCCCTACTTCACAAGTC-3',Antisense:5'-ACTAGGTTTGCCGAGTAG-3';β-Actin引物序列如下,Sense:5'-TGAACCCTAAGGCCAACC-3',Antisense:5'-CCACAGGATTCCATACCC-3'.PCR程序进行反应：首先94℃预变性4min,然后94℃变性45s,55℃复性30s,72℃延伸30s,共循环30次,最后72℃延伸5min,4℃停止。内参基因采用p肌动蛋白(β-actin)用QautityOne软件分析目的基因与内参β-Actin基因的PCR产物灰度值,以目标基因与内参基因灰度比值来表示目的基因mRNA的相对表达量。(4)黄芩苷对核NF-κBp65蛋白表达的影响取对数生长期的细胞以1×106/m的浓度接种于24孔培养板内,待细胞生长至80%融合后,加入不同浓度的黄芩苷(终浓度分别为10,50,100μmol/L)孵育1h,然后加入LPS(终浓度1μg/mL)进行刺激。实验分组如下：正常对照组、黄芩苷组、LPS组和黄芩苷加LPS组；RAW264.7细胞加入刺激物后继续培养30min,以冰冷的PBS终止刺激,用细胞刮子将细胞刮下,5000rpm离心洗涤细胞2次,提取细胞核蛋白,按试剂盒说明书操作。BCA蛋白定量试剂盒测定核蛋白浓度,分装,-80℃贮存备用。核NF-κBp65蛋白的免疫印迹检测,用β-actin单抗做内参。用图象分析系统分析目标带灰度值,以目的蛋白与内参β-Actin蛋白的灰度比值来表示目的蛋白的相对表达量。实验结果1.各组实验小鼠血脂水平(1)高脂血症小鼠模型的建立C57BL/6小鼠用LPS腹腔注射联合高脂饮食,成功建造高脂血症小鼠动物模型。模型建造成功后,单纯高脂模型组比空白对照组血清中TC、TG含量升高(P0.001,P0.01),有统计学意义。高脂+LPS模型组血清中TC、TG含量明显升高,与空白对照组比较差异显著(P0.001)。与空白组相比较,高脂+LPS模型组HDL-C含量降低明显(P0.05),有统计学意义。提示高脂血症小鼠模型（略..）的建立成功。(2)黄芩苷对高脂+LPS模型组实验小鼠血清血脂的影响与高脂+LPS模型组比较,黄芩苷组高剂量和低剂量组的HDL-C含量比模型组均有所升高,其中低剂量黄芩苷组升高尤其明显(P0.001),而高剂量黄芩苷组(P0.01),两者均有统计学意义。黄芩苷组高剂量和低剂量组的TC、TG含量均有下降的趋势,但是没有统计学意义。2.小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的培养在倒置显微镜下观察到RAW264.7为贴壁细胞,形状呈圆形或不规则形,呈“铺路石”样紧密镶嵌排列。3.黄芩苷对RAW264.7细胞因子TNF-α、IL-6生成的影响在正常情况下,巨噬细胞RAW264.7培养上清中TNF-α、IL-6含量极低,100μmol/L浓度的黄芩苷单独作用无明显影响,与正常对照组比较,无统计学意义。1μg/mLLPS刺激可以显著促进RAW264.7细胞TNF-α和IL-6合成,与正常对照组比较P0.01。在10-100μmol/L浓度范围内,黄芩苷预处理均能有效抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6表达,并且存在药物浓度依赖性,与LPS组比较有显著性差异(P0.01)4.黄芩苷对TNF-α、IL-6mRNA表达的影响巨噬细胞TNF-α、IL-6基因在正常情况下表达极低,单独加入黄芩苷对其表达也没有影响。LPS刺激后,巨噬细胞TNF-α、IL-6基因表达上调,而在LPS刺激前加入黄芩苷预处理,可以显著降低TNF-α、IL-6mRNA表达水平。10μmol/L黄芩苷作用组与LPS组比较P0.05,50μmol/L和100μmol/L黄芩苷作用组与LPS组比较P0.01,表明黄芩苷可以有效抑制LPS引起的TNF-α、IL-6基因表达。5.黄芩苷对核NF-κBp65蛋白表达的影响NF-κB在正常情况下以无活性的三聚体形式存在于胞浆中,受胞外刺激活化进入细胞核引起下游多种基因表达,NF-κB通路是LPS诱导炎症因子表达的关键信号通路。WesternBlot结果显示,在正常情况下巨噬细胞胞核内仅有少量的NF-κBp65,在LPS诱导下巨噬细胞NF-κB活化,核内N（略..）F-κBp65含量显著增加。LPS刺激前用黄芩苷预处理,可下调胞核内NF-κBp65水平,说明黄芩苷可以抑制LPS引起的巨噬细胞NF-κB信号途径活化。实验结论黄芩苷的干预使高脂血症小鼠血清HDL-C水平升高,高密度脂蛋白具有抗AS的作用,证实黄芩苷能通过调节血脂的作用而减少动脉粥样硬化的危险因素。这在一定程度上抑制了AS的发生。LPS可以激活巨噬细胞的NF-κB信号分子,细胞核内NF-κBp65蛋白增多,诱导巨噬细胞大量表达炎症因子TNF-α和IL-6。而黄芩苷预处理则可以减轻LPS引起的炎症反应,减少巨噬细胞NF-κBp65入核,降低了NF-κB的活性,从而抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达。实验结果表明黄芩苷能通过抑制NF-κB信号分子活化和炎症因子TNF-α、IL-6的过度表达,抑制炎症反应,从抗炎角度初步明确了黄芩苷抗AS的作用机制。本研究分别采用了体内和体外实验的方法,探讨了黄芩苷在调脂、信号通路的活化以及炎症因子几个方面抑制AS的作用与机制。

以上为本篇毕业论文范文黄芩苷对高脂血症及脂多糖诱导的NF-κB信号通路的影响的介绍部分。

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