结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究

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结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究

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毕业论文范文题目：结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究，论文范文关键词：结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究
结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：冷休克蛋白是广泛存在于各种微生物中的应激蛋白，能够增强细胞抵御冷激胁迫的能力，它属于分子伴侣家族成员，结构上富含芳香族氨基酸，通过结合单链核酸从而调控蛋白表达。大肠杆菌CspA家族是研究最早最深入的冷休克蛋白，其同源蛋白在嗜温、嗜冷和嗜热菌中均大量存在，并与真核生物的Y-box蛋白冷休克结构域同源。近年来，日益增长的证据表明，冷休克蛋白尤其CspA对于病原菌致病、传播以及应对宿主免疫系统等起着重要的作用，然而，它们参与免疫和耐药等的具体机制至今尚未被完全阐明。国内外关于该类蛋白参与致病和药敏的报道较多集中于金黄色葡萄球菌，在结核分枝杆菌中的报道仅局限于蛋白的体外免疫研究，最近有报道冷休克蛋白CspA参与大肠杆菌生物膜的形成，而生物膜又与致病菌的抗药和持续性（略..）感染有密切关系，因而研究该类蛋白将有利于抗致病菌药物的开发。结核病的全球流行使得寻找新的药靶蛋白迫在眉睫，结核分枝杆菌中的冷休克蛋白CspA，它属于结核分枝杆菌培养上清中的滤液蛋白(culturefiltrateprotein，CFP)，为一种可能的T细胞抗原。根据NCBI公布的冷休克蛋白CspA基因序列，设计了一对引物，对结核分枝杆菌基因组进行PCR扩增，获得与预期204bp大小相符的DNA片段，经序列测定确认为目的基因。将该片段克隆至原核表达载体pET32a(+)得到重组质粒pCspA-pET32，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导重组蛋白的表达；表达的CspA融合蛋白采用两种纯化方法，一是经过Ni~(2+)-Sepharose亲合柱对蛋白进行柱层析纯化，二是通过对结核分枝杆菌C（此处忽略..）spA的重组菌进行专一性粗提硫氧还蛋白的“渗透休克法”和传统生化蛋白提纯方法“硫酸铵沉淀”相结合来纯化，通过渗透休克法得到目的重组蛋白粗提液，后采用20～60％的不同硫酸铵饱和梯度进行盐析，沉淀CspA，再通过SDS-PAGE电泳分析及紫外吸收法测蛋白含量，发现渗透休克法结合30％饱和度的硫酸铵盐析，CspA沉淀量最大。并且两种纯化方法对比，可见渗透休克结合硫酸铵纯化蛋白的方法其效果接近于柱层析，并且成本较低，适用于工业生产和规模化放大。纯化的蛋白通过胰蛋白酶消化法鉴定生物学活性，重组CspA中加入长度为35bp的单链DNA，然后在30℃条件下，用胰蛋白酶进行消化，结果发现，加入单链DNA的重组蛋白比起未加单链DNA的重组蛋白，前者受到胰蛋白酶切割能力明显减弱，切割的半衰期显（此处忽略..）著增加，由此可见，正是结合了单链核酸，才对蛋白起到了保护作用，证明重组蛋白CspA是具有结合单链DNA的分子伴侣活性。研究重组质粒pCspA-pET32对宿主菌BL21(DE3)的影响，可知重组蛋白可以增强宿主菌对微量卡那霉素的敏感性。对CspA蛋白进行了相关结构研究。通过SignalP软件分析结核菌CspA，发现作为结核菌分泌蛋白，该蛋白却不含典型的信号肽序列，这点也与文献报道相符。圆二色谱测定重组CspA的二级结构，并与载体pET32a(+)表达蛋白进行对照，发现重组蛋白CspA在远紫外区域的椭圆率是低于对照载体蛋白，因为CspA的a-螺旋区域更短。载体蛋白最高峰值在195nm处，而重组蛋白CspA却发生了红移，最高峰在197nm出现，迁移的原因即来源于重组蛋白CspA的反向平行的β-（本文此处忽略..）折叠。然而，两者的圆二色谱图仍然表现出极大的相似性，由此可见，重组蛋白中新插入的基因表达的蛋白并未显著影响载体蛋白的二级结构。通过圆二色谱实际测定的结果也与通过软件测定的结果一致。以大肠杆菌的CspA的晶体结构作为模板对照，通过同源建模，得到了结核菌CspA的三级结构，发现这两个物种的CspA结构都非常相似，然而结核菌CspA却能引起较强的免疫反应，针对这一疑问，本文对结核菌分泌到胞外空间的蛋白CspA进行计算机分析，根据BIMAS算法筛选其产生的与HLA-1分子结合的九肽，测试其结合能力，筛选可能的免疫表位，从而为结核菌免疫反应以及与之相关的疾病提供理论依据。

以上为本篇毕业论文范文结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究的介绍部分。

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