超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响

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超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响

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毕业论文范文题目：超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响，论文范文关键词：超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响
超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：研究背景近年来,干细胞移植是医学研究的热点,在修复损伤组织如心肌梗塞和脑组织、血管再通以及糖尿病治疗等方面具有十分诱人的前景。进行干细胞移植,首先需要获得足够的干细胞来源。在临床应用性较好的干细胞中,研究较多的是骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymestemcells,BMSCs)和胚胎干细胞(EmbryonicStemcells,ESCs)。BMSCs来源不足(每个成人只能抽取10-20ml骨髓)、抽取骨髓有创等缺点。ESCs不仅存在免疫排斥的问题,还涉及伦理学的问题。因此急需寻找一种来源充分、易被患者接受的干细胞来源。2001年,Zuk等从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次成功分离取得了脂肪间充质干细胞(Adiposetissue-derivedmesenchymalstemcells,ADSCs),为干细胞的来源提供了新的选择,脂肪干细胞的研究越来越受到人们的关注。干细胞移植入活体动物后,需要准确了解移植干细胞在体内迁徙、归巢、增殖及分化,这样才能评价移植疗效、优化移植方法及选择合适的移植窗口期。但是观察干细胞移植后在体内微环境条件下的转化、生存状况一直是困扰学者的一大难题。传统研究方法是处死动物后取得组织做病理检查,此种方法不能满足临床应用的需求,且处死动物后进行离体观察,结果不能真实、准确的反应细胞在活体内的生存状况。超顺磁氧化铁(Supraparamagneticironoxide,SPIO)纳米微粒标记干细胞,然后用MRI能无创、在体示踪细胞,是最具前景的方法之一。Arbab等研究证实,SPIO标记干细胞时,细胞内的铁浓度会较未标记细胞增加数十至百倍。细胞内铁稳态的维持(Cellularironhomeostasis)在细胞生命活动中极其重要；如果细胞内铁超载时,可以潜在诱导氧自由基的生成,导致细胞损伤。因此,了解标记细胞内铁稳态如何维持和调节,是SPIO标记干细胞研究方面所必需重视的课题。维持细胞内铁稳态的最重要的系统为铁调节蛋白/铁反应元件系统(IronRegulatoryPro（此处忽略..）teins/IronResponsiveElementsSystem,IRPs/IREs系统),此系统包括：转铁蛋白受体(TransferrinReceptor,TfR)、铁蛋白(Ferritin,Fn)和铁调节蛋白(IronRegulatoryProteins,IRPs),它们共同参与细胞内铁稳态的维持,其中TfR和Fn的表达均受IRPs在转录后水平上的调控。IRPs通过与TfR和FnmRNA上的高度保守的非翻译区(UntranslatedRegion,UTR)作用得以实现调控功能。TfR和FnmRNA的UTR与IRPs相结合的位点被称为铁反应元件(IronResponseElements,IREs)。SPIO标记干细胞会导致细胞内铁超载,细胞内铁稳态能否得以维持?Pawelczyk等研究发现,使用转染剂硫酸鱼精蛋白介导SPIO标记干细胞时,细胞内的TfRmRNA和蛋白表达水平暂时性减低,而Fn的mRNA和蛋白表达水平保持不变。但Schafer等用流式细胞技术检验了CD71(即转铁蛋白受体),认为使用转染剂介导SPIO标记干细胞对干细胞的基因表达无影响,但他们未对TfR的mRNA和蛋白水平进行定量研究；如果不用转染剂直接对干细胞进行SPIO标记,则会导致细胞的TfR表达上调。在SPIO标记时,细胞内IRPs/IREs系统各蛋白的基因和蛋白表达情况动态变化如何?还有待于进一步研究探讨。因此,本实验使用转染剂左旋多聚赖氨酸(PLL)介导SPIO标记大鼠脂肪干细胞,初步探讨该标记方法对大鼠脂肪干细胞TfR和Fn基因及蛋白表达的影响。研究目的1、建立大鼠ADSCs细胞的体外原代分离、培养、传代及鉴定的实验方法。2、研究转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs细胞的可行性及对干细胞活力和细胞增殖能力的影响。3、研究转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs细胞对干细胞转铁蛋白受体及铁蛋白基因及蛋白表达的影响。材料与方法1、大鼠ADSCs细胞的原代分离、培养、传代及鉴定。取3-4周龄SD大鼠,无菌条件下切取其腹股沟处脂肪组织,切除（略..）肉眼可见的小血管和筋膜,充分剪碎脂肪组织,加入两倍体积的0.25%Ⅱ型胶原酶溶液,37℃消化30-45min,加入适量低糖DMEM+10%胎牛血清完全培养基中和酶活性,1500rpm离心10min后弃上清和未消化组织,最后加入低糖DMEM+10%FBS重悬细胞,移入培养瓶培养。倒置显微镜动态观察干细胞的生长过程,待贴壁细胞近铺满瓶底70-80%时,可以用含EDTA的胰酶消化,进行传代培养。取第3代细胞绘制第1-7天的细胞生长曲线。并用流式细胞仪检测干细胞表面抗原CD29、CD31、CD34及CD44的表达情况。2、转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs细胞的可行性及其对干细胞活力和增殖能力的影响。本试验使用第三代干细胞(P3),所用SPIO试剂为Resovist(Schering,Berlin,Germany),原始浓度为28mg/ml、PLL介导SPIO标记干细胞方法：无血清培养基按比例加入SPIO和PLL,室温下置于摇床混匀30min(30r/min);加入有贴壁干细胞且铺满瓶底约90%的培养瓶内,37℃、5%CO2孵箱内培养24h；PBS洗涤标记细胞3次,除去多余SPIO待用。标记后细胞经过普鲁士兰染色,用光学显微镜观察细胞标记铁的情况。将浓度分别为0、12.5、25、50、75μg/mlSPIO加入六孔培养板各孔中与PLL及干细胞共培养12h后,用台盼蓝排斥实验检测细胞活性。将0及50μg/ml浓度的SPIO加入六孔培养板与PLL及干细胞共培养,分别在标记后第1、3、5、7、9天进行MTT试验检测细胞增殖能力。3、转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs细胞对干细胞转铁蛋白受体及铁蛋白基因及蛋白表达的影响。本实验采用转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSc细胞,分别在标记前0h、标记后第2h、41h、8h、16h.24h.4d、1w、2w、3w、4w用Trizol法提取细胞总RNA,然后配制逆转录反应液,以37℃15min,85℃5sec的反应条件进行逆转录反应,获得cDNA。测定cDNA的浓度,依据浓度比例按试剂说明书配制PCR反应液,进行两步法实时定量PCR。依所得的CT值定量计算在上述不同时间点转铁蛋白受体和铁蛋白轻链mRNA的表达量。另分别在标记前0h、标记后16h、（本文此处忽略..）24h、4d、1w、2w、3w、4w用裂解液和蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白,并用BCA法测定不同时间点的蛋白浓度,进行WesternBlot实验,其步骤大致如下：①变性、还原蛋白,②制备聚丙稀酞胺凝胶,③蛋白上样,④电泳,⑤转膜,⑥丽春红染色,⑦封闭PVDF膜的免疫球蛋白结合位点,⑧洗膜,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,⑨ECL显示,并用胶片曝光。将所得结果用扫描仪扫描,用MolecularAnalysis图象分析软件定量分析上述不同时间点转铁蛋白受体和铁蛋白轻链蛋白表达结果。结果1、运用25%Ⅱ型胶原酶消化大鼠脂肪的方法,能够在体外成功分离培养出大鼠脂肪干细胞。原代培养的细胞形态呈多形性,随着培养时间和传代次数的增加所得到的细胞形态变得比较均一,呈梭形。细胞生长曲线显示细胞增生活跃。对第4代细胞进行流式细胞仪检测,发现98%的细胞表达CD29,97%的细胞表达CD44,而只有5%的细胞表达CD34,这一结果符合间充质干细胞的特征。2、转染剂PLL介导SPIO能简单、高效的标记大鼠ADSCs细胞,在一定浓度范围内对干细胞活力及增殖能力无明显不可逆影响。普鲁士蓝染色证实SPIO标记大鼠脂肪干细胞胞后,细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒。SPIO的浓度分别为12.5、25、50、75μg/ml时,光学显微镜下观察标记组细胞标记率达100%时间分别为48h、36h、24h、12h,可见细胞内铁颗粒的浓度随孵育时间、标记浓度的增加而增加。台盼蓝染色检测细胞活力实验发现SPIO浓度分别为12.5、25、50、75μg/ml时,经单向方差分析,各组之间差异无统计学显著意义(F=1.512,P=0.271)。MTT法检测细胞增殖能力,在Id,3d,5d,7d,9d分别测吸光光度值发现在标记后第1d(t=2.798,P=0.049)和第3d(t=3.164,P=0.034),标记组细胞增殖能力略低于未标记组；在第5d(t=1.867,P=0.135),7d(t=2.671,P=0.056),9d(t=0.979,P=0.383)标记组和未标记组细胞增殖能力之间差异无显著性意义(P0.05)。3、转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs后,Fn-L基因及蛋白表达水平会暂时性升高,TfR基因表达水平会暂时降低而蛋白表达水平无明显改变。Fn-LmRNA表达见表1。（此处忽略..）TfRmRNA表达见表2。接着,我们用WesternBlot实验的方法对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链的蛋白表达水平进行了定量检测,Fn-L蛋白表达见表3；TfR蛋白表达在标记与未标记组之间差异无统计学显著性意义(F=3.555,P=0.132)。表2SPIO标记对ADSCsTfRmRNA表达的影响(X±S)*主效应的F统计量和P值；#交互效应F统计量和P值两均数比较采用独立样本t检验分析组内不同时间点多均数比较采用重复测量方差分析表3SPIO标记对ADSCsFn-L蛋白表达的影响(X±S)*主效应的F统计量和P值；#交互效应F统计量和P值两均数比较采用独立样本t检验分析组内不同时间点之间均数比较采用重复测量方差分析结论本研究表明在体外运用胶原酶消化大鼠脂肪,能够分离培养出大鼠ADSCs,具有可行性,且获得的细胞表型较均一,增殖能力活跃。运用转染及PLL介导SPIO可以简单、高效的标记大鼠ADSCs,且在一定的浓度范围内,对标记后细胞的活力及增殖能力无明显不可逆的影响。在一定浓度范围内,PLL介导SPIO标记脂肪干细胞后对Fn-L基因及蛋白表达及TfR基因表达的影响只是暂时性的,而对TfR蛋白表达无明显影响；这表明在一定浓度范围内,PLL介导SPIO标记干细胞未对Fn-L及TfR的基因及蛋白表达产生不可逆的影响。

以上为本篇毕业论文范文超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响的介绍部分。

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