姜黄素活化ARE通路对星形胶质细胞保护作用的研究及机制探讨

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姜黄素活化ARE通路对星形胶质细胞保护作用的研究及机制探讨

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毕业论文范文题目：姜黄素活化ARE通路对星形胶质细胞保护作用的研究及机制探讨，论文范文关键词：姜黄素活化ARE通路对星形胶质细胞保护作用的研究及机制探讨
姜黄素活化ARE通路对星形胶质细胞保护作用的研究及机制探讨毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：氧化应激是由活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮族(reactivenitrogenSpecies,RNS)产生与清除失调引起。许多实验研究和对人脑的研究表明氧化应激介导了神经元的死亡并在神经变性疾病中发挥重要作用,如:肌萎缩侧索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis,ALS)、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)。涉及ROS的氧化还原反应调节对于细胞正常功能的发挥尤其对于神经元和星形胶质细胞起到重要作用。ROS产生过多损伤脂质、蛋白质、DNA及诱导凋亡。目前研究着重于星形胶质细胞功能异常在神经变性疾病发生发展中的作用。活化的星形胶质细胞产生大量自由基并促进神经元凋亡;产生过多的一氧化氮和过氧化亚硝酸盐损伤线粒体并促进NMDA受体诱导的兴奋毒性作用。兴奋性氨基酸转运依赖位于星形胶质细胞和轴突间隙的高亲和力谷氨酸转运体对释放到胞外谷氨酸的迅速清除。ROS诱导的氧化损伤和脂质过氧化通过氧化转运体主要的巯基基团,抑制星形胶质细胞高亲和力谷氨酸转运体,干扰对胞外谷氨酸的摄取。活化的星形胶质细胞产生细胞因子使神经元对氧化应激的易损性增加。其中一些细胞因子,如:FasL、TNF-a和NGF,活化中枢神经系统病变部位的死亡受体,这些受体对于神经变性疾病中神经元的丢失起到重要作用。在运动神经元变性过程中牵涉到许多星形胶质细胞损伤机制,虽然这些机制都在运动神经元损伤的启动或发展中起作用,但并不是互相排斥而是可以被一个共同的反应所激活,这一共同的反应的协调者正是氧化应激。不断（此处忽略..）增加的氧化应激在导致运动神经元损伤的过程中,是出现较早且持久的事件。氧化应激在神经变性疾病发病中起到了突出的作用,并且它通过活化其它各个通路,引起更新一轮的氧化应激,促进了疾病的进展。内源性Ⅱ相解毒酶,如:γ-谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位(γ-glutamylcysteineligasecatalyticsubunit,GCLC)、血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1、(NAD(P)H:QuinoneOxidoreductase1,NQO1)和谷胱甘肽S转移酶(GlutathioneS-Transferase,GST)等在保护细胞抵御氧化应激损伤过程中起到重要作用。许多神经变性疾病的病因与ROS的积聚有关,细胞中和这些反应中间产物的能力很大程度上依赖一个顺式作用元件的活化,这个顺式作用元件被命名为抗氧化反应元件(antioxidantresponseelement,ARE)。它存在于抗氧化蛋白和解毒酶基因的5’端区域。在人类、大鼠、小鼠的多种组织中及原代培养的星形胶质细胞、神经元中都已证实,ARE驱动的靶基因包括GCLC、HO1,NQO1和GST等。碱性亮氨酸拉链(basicleucinezip-per,bZIP)蛋白家族的转录因子Nrf2(nuclearfactorE2p45-relatedfactor2)被激活后,向核内转位,与Maf等转录因子形成杂化二聚体结合到ARE元件,参与下游Ⅱ相酶基因的调控,启动下游抗氧化酶的表达。Nrf2可被多种物质活化,从而激活Nrf2-ARE通路诱导抗氧化Ⅱ相酶的表达,提高细胞抗氧化能力。本研究基于神经变性疾病中氧化应激的病理改变,给予原代培养（此处忽略..）的星形胶质细胞强氧化剂H2O2处理引起氧化损伤,建立氧化应激模型。基于此模型,研究内源性抗氧化酶诱导剂的神经保护作用。本课题应用姜黄素,观察其在该模型中对星形胶质细胞抗氧化能力的影响及对氧化损伤的保护作用,并进一步探讨保护作用机制。论文共分三部分:第一部分探讨星形胶质细胞氧化损伤模型的建立;第二部分证实姜黄素对H2O2诱导的星形胶质细胞氧化损伤存在保护作用,并且这种保护作用与Ⅱ相抗氧化酶的上调有关;第三部分进一步探讨姜黄素在星形胶质细胞中所致Ⅱ相解毒酶上调的机制及对星形胶质细胞氧化应激易损性的影响。第一部分原代培养星形胶质细胞氧化应激模型的建立目的:基于星形胶质细胞氧化应激在神经变性疾病中的作用,建立原代培养星形胶质细胞氧化应激模型。为进一步对氧化应激进行深入研究以及抗氧化药物的筛选奠定了基础。方法:取出生后1-2天Nrf2双等位基因存在(Nrf2+/+)小鼠脊髓,应用胰酶消化法进行原代星形胶质细胞培养、鉴定及纯化。纯化后的第Ⅱ代细胞培养7天后,在培养液中加入25μmol/LH2O2作用30分钟后去除,加入新培养液。用抗胶质细胞酸性纤维(GFAP)抗体进行免疫组化染色,激光共聚焦显微镜进行观察;四甲基噻唑蓝(MTT)法进行细胞活力分析;检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)及丙二醛(MDA);2,7-dichlordi-hydrofluorescein(DCFH-DA)探针检测细胞内ROS含量,均与对照组做比较。结果:培养第Ⅰ代星形胶质细胞GFAP阳性细胞数达85%以上;培养第Ⅱ代星形胶质细胞GFAP阳性细胞数达95%以上。H2O2干预组星形胶质细胞与对照组相比细胞活力下降、胞液中LDH和MDA含量升（此处忽略..）高,ROS生成增多。结论:本研究成功地进行了原代星形胶质细胞体外培养、纯化及鉴定。使用H2O2引起星形胶质细胞氧化损伤,造成氧化应激模型。第二部分姜黄素对H2O2诱导的星形胶质细胞氧化损伤影响以及与Ⅱ相抗氧化酶关系目的:观察姜黄素对H2O2诱导的星形胶质细胞氧化损伤的影响及对Ⅱ相酶的作用。方法:给予原代培养星形胶质细胞预孵育5、10、15、20、25μmol/L姜黄素24小时后,给予25μmol/LH2O2作用30分钟。MTT法进行细胞活力分析;检测细胞培养液中MDA含量;DCFH-DA探针检测细胞内ROS生成;提取组织匀浆蛋白,用免疫印迹检测Ⅱ相酶的蛋白水平;激光共聚焦显微镜免疫染色法观察HO1、NQO1表达情况,均与对照组做比较。结果:5、10、15umol/L姜黄素可以上调NQO1、HO1、GCLC表达,且10umol/L姜黄素上调程度最高。细胞活力升高,MDA水平下降,ROS生成减少。20、25μmol/L姜黄素未见明显改变且使细胞培养液中LDH水平升高,表明存在细胞损伤。结论:姜黄素对H2O2诱导的星形胶质细胞氧化损伤具有保护作用且与Ⅱ相酶的上调有关。第三部分探讨姜黄素在星形胶质细胞中所致Ⅱ相酶上调的机制及对星形胶质细胞氧化应激易损性的影响目的:Nrf2被激活后向核内转位,结合到ARE元件,参与下游Ⅱ相酶基因的调控,探讨姜黄素在星形胶质细胞中所致Ⅱ相解毒酶的上调的机制是否通过活化Nrf2-ARE通路有关,及姜黄素对星形胶质细胞氧化应激易损性的影响方法:分别给予Nrf2+/+和Nrf2-/-原代培养星形胶质细胞预孵育10μmol/L姜黄素24小时后,提取组织匀浆蛋白,用免疫印迹检测Ⅱ相酶的蛋白水平。分别给予Nrf2+/+和Nrf2-/-原代培养星形胶质细胞预（此处忽略..）孵育10μmol/L姜黄素24小时后,给予25μmol/LH2O2作用30分钟,提取组织匀浆蛋白,用免疫印迹检测Ⅱ相酶及Nrf2蛋白水平;MTT法进行细胞活力分析;细胞培养液中LDH及MDA检测;DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量;激光共聚焦显微镜免疫染色法观察Nrf2核内移变化,均与对照组做比较。分别给予Nrf2+/+和Nrf2-/-原代培养星形胶质细胞预孵育10μmol/L姜黄素24小时后再给予50、100、200、300、400、500μmol/LH2O2作用30分钟,MTT法进行细胞活力分析。均与对照组比较。结果:姜黄素促进Nrf2核移位,上调核内Nrf2蛋白表达水平。Nrf2+/+星形胶质细胞预孵育姜黄素后与对照组相比HO1、NQO1及GCLC蛋白表达水平升高,ROS的生成及MDA含量明显减少,细胞活力升高。来自Nrf2-/-原代星形胶质细胞检测中,同样给予姜黄素孵育未见明显变化。暴露于浓度递增的H2O2中时,Nrf2-/-星形胶质细胞细胞活力先于Nrf2+/+星形胶质细胞呈现下降趋势;姜黄素预孵育后Nrf2+/+星形胶质细胞细胞活力显著升高而Nrf2-/-星形胶质细胞未见明显变化。结论:姜黄素可以通过活化Nrf2-ARE通路,上调星形胶质细胞中Ⅱ相酶的表达及减弱星形胶质细胞对氧化应激的易损性。

以上为本篇毕业论文范文姜黄素活化ARE通路对星形胶质细胞保护作用的研究及机制探讨的介绍部分。

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