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金葡素注射液中质控指标SEC含量检测方法的建立及相关肠毒素生物

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毕业论文范文题目:金葡素注射液中质控指标SEC含量检测方法的建立及相关肠毒素生物,论文范文关键词:金葡素注射液中质控指标SEC含量检测方法的建立及相关肠毒素生物
金葡素注射液中质控指标SEC含量检测方法的建立及相关肠毒素生物毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:超抗原是指一类逆转录病毒蛋白和细菌毒素,它们无需抗原递呈细胞的加工,可直接与抗原递呈细胞的MHCⅡ及T细胞表面的TCR结合并激活T细胞。由于极微少的量即可以激活大量的T细胞,因而称之为超抗原。作为一类超抗原蛋白,肠毒素(SEs)能对人体免疫系统同时产生急性和长效的作用:急性作用包括食物中毒和中毒性休克;长效作用则包括自体免疫疾病和免疫缺陷如遗传性过敏症、川崎病等。但是如果利用得当,肠毒素就能刺激机体白细胞大量增殖从而加强免疫应答,增强机体免疫力;而且可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用,从而产生机体的抗肿瘤反应。在我国,金黄色葡萄球菌滤液制剂作为肿瘤放化疗治疗的辅助药物应用于临床已有十年,目前临床上使用的抗肿瘤金葡素注射制剂主要有沈阳协合生物制药股份有限公司生产的高聚生,浙江耀江药业有限公司生产的恩格菲和杭州国光药业有限公司生产的思复胜。沈阳协和生物制药股份有限公司提出金葡素制剂的可能活性成分为SEC,并建立了一个用于SEC含量检测的ELISA检测方法,临床上其他的金葡素制剂亦以SEC的标示量作为该制剂的质量控制标准,而且是唯一一个标明具体含量的成分。虽然目前金葡菌滤液制剂已取得了广泛的应用,并在临床上证明安全有效,但由于该类型的制剂都是由金葡菌分泌上清所得,制剂中存在着大量的蛋白质以及多肽类杂质,成分复杂,而且没有可靠可信的研究确定其真正的有效成分,在用药安全和质量控制上存在着很多问题。首先,假设SEC是金葡素制剂中的活性成分,协和生物制药公司的SEC检测试剂盒并没有在市面上销售,其可信性和准确性都难以验证。目前临床上使用的金葡素制剂中SEC确切的含量事实上仍不可知,并且缺乏产品间批次间SEC确切含量的质量控制标准。临床上对各厂家的产品在治疗的安全性和治疗效果的差异方面也没有具(本文此处忽略..)体的对比数据。为避免超抗原激活全身大量T细胞而引发机体免疫功能紊乱,并导致多种急慢性、自身免疫性疾病产生危险,剂量和给药途径是临床应用的关键。因此,亟需建立严格可控的质量标准,一种灵敏、快速、简易的定性定量地检测肠毒素的方法不仅能作为食物中毒和获得性感染的检测手段,更能成为临床抗肿瘤金葡素制剂生产的新工艺标准和质量控制标准,为临床疾病诊断以及抗肿瘤治疗提供良好的工具和手段。其次,SEC是否是真正的有效成分?是唯一的还是与其他成分共同作用的?目前该类型制剂中SEC相对含量极低,标示量都在10ng/ml。制剂中大量的杂蛋白有没有抗肿瘤活性,或者只是引起毒副作用的因素?到目前为止,已有大约20种肠毒素被发现,其中包括SEA、SEB、SEC_(1-3)、SED和SEE等经典肠毒素型和后来发现的SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK以及新发现的SEM、SEN、SEO和SEU等等。金葡菌肠毒素家族有着类似的活性,但不同的血清型在作用位点、具体作用机制上也不同的方式。金葡素制剂中是否还含有其他类型的肠毒素,与SEC共同作用?肠毒素之间是否存在着协同作用?是否存在活性和安全性较SEC更高的肠毒素或者肠毒素的组合?随着越来越多的肠毒素的发现,如何筛选、组合和开发金葡菌肠毒素,以求减少在使用过程中产生的毒副作用并增强抑制肿瘤的疗效,也是一个亟待解决的课题。为实现上述目标,本研究设计了如下实验方案:一方面,针对金葡素制剂质量控制方面的问题,开发一种临床适用的SECELISA检测方法;另一方面,通过建立一种肠毒素体外活性筛选模型对金葡素制剂以及相关肠毒素的活性进行初步的比较研究。在SECELISA检测方法的建立上,首先选择本实验室以基因工程的方法克隆表达纯化得到的具有生物学活性的两种重组肠毒素C_2蛋白为免疫原分别免疫(文章此处忽略..)BALB/c小鼠和新西兰大白兔,获得单克隆抗体和多克隆抗体;其次使用这两种抗体建立起敏感快速的双抗体夹心ELISA法;再次,在此双抗体夹心ELISA法的基础上,引入生物素—链霉亲合素系统,最后建立起一种适用于抗肿瘤药物金葡素注射液质控指标SEC含量检测的生物素—链霉亲和素酶联免疫吸附方法(BA-ELISA)。在肠毒素活性研究方面,首先建立肠毒素活性研究的体外初筛模型;其次,使用该模型对高聚生、恩格菲两种金葡素注射液以及本实验室制备的多种肠毒素增殖小鼠脾淋巴细胞的活性进行了比较;再次,进一步两两等质量比混用多种肠毒素,对各血清型的肠毒素之间可能存在的协同作用进行初步的探索,为进一步筛选和开发高效低毒的肠毒素药物提供依据。A.金葡素注射液中质控指标SEC含量检测方法的建立1.肠毒素SEC_2蛋白多克隆抗体、单克隆抗体的制备、鉴定及纯化1.1肠毒素SEC_2蛋白多克隆抗体的制备和鉴定将带有6个组氨酸标记的SEC_2-His蛋白按比例与福氏佐剂混合,新西兰大白兔背部皮下多点注射免疫,共免疫四次后,在兔耳缘静脉取血,琼脂糖免疫双扩散法测定其抗体效价为1:8,间接ELISA法测定抗体免疫效价为1:4×10~6,并用Westernblotting法鉴定其特异性。从兔心脏穿刺取血,收集抗体血清。1.2多克隆抗体的纯化采用辛酸—硫酸铵法两步纯化多克隆抗体。先用辛酸除去大量血清中的白蛋白,调整好pH值后加入固体硫酸铵,取沉淀溶于一定量的透析液中,并在透析液中透析48h除去硫酸铵。将透析后的蛋白离心去除沉淀杂质,即可得到较纯的抗体蛋白。1.3肠毒素SEC_2蛋白单克隆抗体的筛选经过多次筛选和有限稀释,在本实验室保存的五株单克隆抗体细胞中选择出效价最高的202杂交瘤细胞株。天然金葡菌分泌的SEC_2蛋白作为抗原包被酶标板,杂交瘤细胞免疫腹水用PBS倍比稀(文章此处忽略..)释后与之结合用以检测其效价。测定的结果表明,202细胞株腹水单抗效价为2×10~5。1.4单克隆抗体的纯化利用IgG能与蛋白A亲和结合的特性,将收集的杂交瘤细胞免疫腹水通过蛋白A亲和层析柱,缓冲液洗去非特异性吸附的杂蛋白后,用低pH值的缓冲液将结合在蛋白A亲和层析柱上的抗体洗脱下来。由SDS-PAGE结果可知,已获得较纯的抗体免疫蛋白。2.SEC蛋白检测方法的建立2.1双抗体夹心ELISA检测方法的建立抗SEC_2单克隆抗体包被酶标板,以免抗SEC_2多克隆抗体为第二层抗体,形成双抗体夹心,与抗原SEC_2蛋白特异性结合,再加入标记有辣根过氧化物酶(HRP)的三抗与底物进行显色测定,建立起一套肠毒素SEC_2双抗体夹心ELISA检测方法。2.2生物素—链霉亲合素ELISA检测方法的建立在双抗体夹心ELISA检测方法的基础上,引入生物素—链霉亲合素系统,以扩大反应信号。抗SEC_2单克隆抗体包被酶标板作为捕获抗体,兔抗SEC_2多克隆抗体为测定抗体,形成双抗体夹心,与抗原SEC_2蛋白特异性结合,再加入生物素标记的三抗和标记有辣根过氧化物酶的链霉亲合素与底物进行显色测定。建立起一套适用于临床金葡素注射液SEC含量检测的BA-ELISA检测方法。B.金葡素注射液与相关肠毒素生物学活性的比较研究1.肠毒素体外活性研究模型的建立选择野生型肠毒素SEC_2(nSEC_2)和重组肠毒素SEC_2(rSEC_2)为研究对象,以ICR小鼠脾淋巴细胞为效应细胞,小鼠黑色素瘤B16细胞、慢性髓原性白血病K562细胞和耐药慢性髓原性白血病K562-ADM细胞为靶细胞,以有丝分裂原ConA为阳性对照,采用MTT法,选择适合的条件,建立合适的体外模型来观察肠毒素对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及对肿瘤细胞的体外杀伤活性。2.单用金葡素注射液及八种金黄色葡萄球菌肠毒素对体外小鼠脾淋巴细胞的(略..)增殖作用应用建立的肠毒素体外活性研究模型,对高聚生、恩格菲两种金葡素注射液以及rSEA/rSEO/rSEM/rSEN/rSEG/rSEC_2/nSEC_2/rSEI的增殖小鼠脾淋巴细胞的活性进行了比较研究。3.七种肠毒素两两混用对体外小鼠脾淋巴细胞的增殖作用应用建立的肠毒素体外活性研究模型,对两两等质量比混用七种重组肠毒素rSEA/rSEO/rSEM/rSEN/rSEG/rSEC_2/rSEI后对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用进行了实验,对两两等质量比混用可能产生的肠毒素之间的协同作用进行了初步探索。综上所述,本课题首先建立了一种适用于金葡素注射液质控指标SEC含量检测的BA-ELISA法,该方法灵敏度高、准确性好、重复性好、特异性高,为二十余种肠毒素分型的定量检测方法的建立奠定了良好的基础。应用该方法对三种金葡素注射液中SEC含量进行检测,发现其中存在着含量与标示量不符的情况;同时,注射液中均含有99.9%以上成分不明的杂蛋白,威胁着用药安全。其次建立了一种适合肠毒素活性研究的体外初筛模型,应用该模型对两种金葡素注射液以及八种不同肠毒素的增殖淋巴细胞的活性进行了比较,结果表明金葡素注射液与SEC_2活性相当,提示可以通过基因工程的手段制备高纯度的肠毒素制剂代替金葡菌滤液制剂:SEI、SEM、SEN则表现出更高的活性,有望成为抗肿瘤药物,存在进一步筛选的价值;在此基础上首次对肠毒素之间可能存在的协同作用进行了初步研究。本实验是对如何筛选、组合和开发金葡菌肠毒素课题的探索,也为进一步筛选和开发高效低毒的肠毒素药物提供了依据。


以上为本篇毕业论文范文金葡素注射液中质控指标SEC含量检测方法的建立及相关肠毒素生物的介绍部分。
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