内毒素休克小鼠IP-10启动子结合蛋白的鉴定及其功能研究

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内毒素休克小鼠IP-10启动子结合蛋白的鉴定及其功能研究

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毕业论文范文题目：内毒素休克小鼠IP-10启动子结合蛋白的鉴定及其功能研究，论文范文关键词：内毒素休克小鼠IP-10启动子结合蛋白的鉴定及其功能研究
内毒素休克小鼠IP-10启动子结合蛋白的鉴定及其功能研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：干扰素诱导蛋白10(interferoninducibleprotein10，IP-10)，是新近发现的CXC类重要的趋化因子家族成员。IP-10通过与其特异性受体CXCR3结合，在机体发挥重要的生物学功能，杀灭微生物、抗病毒、抗肿瘤、介导Th1型免疫反应等。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的内毒素休克中，LPS激活单核巨噬细胞、内皮细胞合成和释放各种细胞因子和黏附分子，其中IP-10作为一种重要的细胞因子其表达量异常的升高，且在内毒素休克小鼠的肝脏、肺脏、肾脏中IP-10的表达量均显著升高。IP-10通过趋化炎性细胞到达炎症组织，在一定程度上发挥杀灭病原体的作用，但过强的免疫反应又会对机体造成损害，引起全身炎症反应综合征，严重者导致机体发生多器官功能不全综合征。IP-10在机体多种组织和细胞中都有表达，包括单核巨噬细胞、活化的成纤维细胞、内皮细胞、各种淋巴细胞等三十多种细胞，且多种刺激均能上调或下调IP-10基因的表达，如干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、干扰素α(interferon-α，IFN-α)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白介素4(interleukin，IL-4)、白介素12(interleukin，IL-12)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等。不同刺激在不同细胞、不同种系可能通过不同的信号通路诱导IP-10基因的表达，相关的调控机制也不尽相同。目前对鼠源性IP-10同源物细胞因子反应性基因(cytokineresponsivegene-2，crg-2)的信号通路已有一些研究，但对IP-10相关的调控机制及其在内毒素休克模型中的表达机制则知之其少。基因表达的调控是细胞对外部或内部的刺激发生应答的方式，这是一个高度复杂，精确调控的过程，基因转录表达调控可以在复制、扩增、转录、转录后、翻译和翻译后多等级（文章此处忽略..）水平上进行，但mRNA转录起始是基因表达调控的基本控制点，即在一定时间、空间特异性的基础上，由特异基因的启动子与调节蛋白的相互作用来决定的。其实质即DNA-蛋白质／蛋白质-蛋白质间的相互作用对RNA聚合酶活性的影响。另外，人们发现，在基因调控过程中，往往不是单个因素起作用，而是多种调节因素相互交织，相互影响，形成复杂的调控网络，最终使基因表达调控呈现出一种高度的有序性。鉴于这种广泛的蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA相互作用网络参与其中，相关研究策略也层出不穷。其中，启动子DNA结合蛋白的研究是从转录水平上研究基因表达的调节，以寻找新的蛋白质为手段，以了解其转录调节作用为目的，从而最终为阐明某些疾病的发病机制及基因治疗奠定基础。目前，对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两大类：第一类是细胞内法，以已知启动子DNA序列筛选出与其相结合的蛋白的编码基因，通过生物信息分析来确定该蛋白质；第二类是细胞外法，即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合。二者各有其自身的优势，但又都有各自的缺陷。我们以细胞外法为基础，将以上二者结合应用，以期达到既能找到未知调控蛋白，又能够找到该蛋白质的精确的结合位点并证实二者结合特异性的目的。由此，我们从“组学”的角度和活体组织水平，根据DNA-蛋白质相互作用的原理，基于生物素-链亲和素系统、磁珠分离技术，结合生物质谱技术筛选了内毒素休克小鼠的肝脏组织中与IP-10启动子发生相互作用的结合蛋白，并对鉴定出的重要调控元件高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1，HMGB1)进行了进一步的体外结合验证及对IP-10基因的转录调节作用等方面的深入研究。利用末端生物素(biotin)标记的IP-10启动子区引物，PCR扩增制备IP-10启动子区探针(IP-10p-biotin)。制备内毒素休克动物模型(BALB／c小鼠)，提取肝脏组织胞核蛋白，与扩增的IP-10p-bioti（略..）n探针行结合反应，再以标记有链亲和素(streptavidin)的磁珠分离IP-10p-biotin-蛋白反应复合物，不同盐浓度缓冲液洗脱结合的蛋白，使用聚丙稀酰胺凝胶电泳分离洗脱的样品蛋白，并对凝胶行银染显色，比较内毒素休克组与正常对照组的差异条带(DNApull-downassay)。结果表明，在肝脏组织胞核中，共有17个蛋白可能参与了内毒素休克小鼠肝脏中IP-10的表达调控。其中14个蛋白在LPS作用后与IP-10启动子结合增加，提示这些蛋白在LPS作用后可能参与了IP-10的转录调节，而另外3个蛋白则在LPS作用后，与正常对照组相比作用减弱或消失，且多次重复均得到相同的结果。对结果中出现的17个差异条带行切胶进行质谱鉴定，根据得到的肽指纹图谱，利用Mascot查询软件搜索NCBI数据库，综合分析后得到五个与转录调控有关的蛋白分子，分别为高迁移率蛋白家族的高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1，HMGBl)和高迁移率族蛋白2(highmobilitygroupbox2，HMGB2)，组蛋白3(histone3，H3)，乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoenzymeAacyltransferase2，ACAA2)及甲状腺激素受体相关蛋白(thyroidhormonereceptorassociatedproteins，TRAP)。其中，HMGB1、HMGB2最初发现其即作为核因子参与基因的转录调控，它们主要通过修饰，弯曲或改变染色质／DNA的结构，促进各种蛋白因子形成大分子复合物来调节基因转录；组蛋白H3作为染色体结构中高度保守的一类核心组蛋白(corehistone)，主要通过其乙酰化水平的调节控制基因转录的“开”和“关”；乙酰辅酶A酰基转移酶则通过对组蛋白、HMGB1、HMGB2的乙酰化参与基因调控；甲状腺激素受体相关蛋白是新进研究的转录协调因子的一类中介因子，它主要通过与转录激活因子、RNA聚合酶Ⅱ及基本转录因子(ge（此处忽略..）neraltranscriptionfactors，GTFs)相互接触从而促进转录起始复合物的装配。质谱鉴定得到的这些结果充分说明内毒素休克小鼠中IP-10基因的表达调控可能受到了多种因素的影响，这些因素相互协调，共同作用从而影响IP-10基因的表达调控。鉴于HMGB1在转录调控中的重要作用，我们将其作为IP-10基因调控中的重要因子对其进行了多方面的验证，主要包括体外结合实验，细胞免疫荧光和Westernblotting分析体外IP-10与HMGB1的结合活性、内源性的HMGB1的定位及其表达情况。首先，表达纯化出带组氨酸(His)标签的HMGBl融合蛋白，将其包被至耦合有镍离子的荧光微球上，将其与末端带biotin标记的IP-10启动子全长以不同的摩尔比行体外结合反应，加入耦联有链霉亲和素的荧光发光剂PE后，利用液相芯片系统(LiquiChipworkstation)检测各组DNA-蛋白的结合强度。结果发现HMGB1同IP-10启动子在体外有高亲合力，且当DNA：protein投入的摩尔比为2：1时，二者的结合趋于平台期。这个结果同己知的HMGB1蛋白上存在两个DNA结合结构域(HMGbox结构域)相一致。同时，我们用Westernblot检测内毒素休克小鼠肝脏组织中HMGB1蛋白的表达情况，结果显示在LPS刺激后胞核蛋白中HMGB1的表达量0.5h开始增多，随后恢复至正常，至3h又有所增高，之后开始逐渐下降，同时总蛋白也有类似的变化趋势。此外，在我们用培养的人肝癌细胞株SMMC7721细胞，检测内源性的HMGB1的定位试验中观察到LPS刺激后早期，HMGB1特异的定位于细胞核内，这样的结果提示我们HMGB1作为核因子主要在基因表达的早期参与调控，而且我室早期的研究工作即表明，在LPS刺激的内毒素休克小鼠肝脏组织中1h即检测到IP-10的升高，且在3h达到高峰，由此可以初步推断HMGB1在IP-10基因表达调控过程中，主要应该发生在转录水平的改变，（本文此处忽略..）即早期使HMGB1的表达增加，从而参与调控早期IP-10基因的上调。通过以上研究，我们得出以下结论：一：利用生物素-链亲和素、磁珠分离技术成功筛选到参与IP-10基因调控的转录因子，在胞核蛋白中至少有17个蛋白可能参与了这一过程，并利用生物质谱技术鉴定相关蛋白为HMG家族的HMGB1与HMGB2，组蛋白H3，乙酰基转移酶，甲状腺激素受体相关蛋白；二：在原核细胞内表达纯化出带His标记的HMGB1蛋白，并与末端带biotin标记的IP-10启动子全长以不同的摩尔比体外结合，利用Liquichip液相芯片分析系统在体外验证了二者的相互作用，在DNA：protein为2：1时，二者的结合趋于平台。三：细胞免疫荧光、Westernblot结果表明，在LPS刺激的小鼠肝脏组织胞核蛋白中，早期HMGB1的表达即明显升高，且细胞定位实验也在核内检测到HMGB1的表达，提示HMGB1对IP-10的表达调控作用主要发生在内毒素休克的早期，从而发挥IP-10在内毒素休克早期对机体的保护作用。本研究利用DNA-蛋白质相互作用的原理，为从“转录调控组学”的角度分析基因的转录表达调控过程及其机制开创了新的思路。同时差异条带的出现说明在内毒素休克小鼠中IP-10的转录调控发生了较为复杂的变化，可能有多种核蛋白或转录因子参与了这一过程。这些蛋白的鉴定对于我们深入理解IP-10基因表达调控有重要的意义，同时也将为临床治疗内毒素休克提供新的理论依据及可能的治疗靶点。

以上为本篇毕业论文范文内毒素休克小鼠IP-10启动子结合蛋白的鉴定及其功能研究的介绍部分。

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