人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究

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人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究

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毕业论文范文题目：人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究，论文范文关键词：人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究
人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的1人血小板因子4(hPF4)原核高效表达克隆的构建2重组hPF4的表达及分离、纯化工艺研究3重组hPF4的特性研究方法根据原核细胞表达真核蛋白的基因表达调控特点，设计合成一对特异引物，在PT7-7-rPF4表达质粒的基础上，应用聚合酶链式反应(PCR)对其cDNA进行改造，通过DNA重组技术构建成重组hPF4原核表达质粒PBV220-rhPF4，用快速PCR检测法、DNA测序分析，鉴定重组hPF4表达质粒的正确性。PBV220-rhPF4用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，温控诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blotting鉴定表达产物。采用超声结合溶菌酶法破碎大（文章此处忽略..）肠杆菌，分析蛋白表达形式，可溶性重组蛋白部分用肝素—琼脂亲和层析、RP-HPLC纯化重组hPF4，非可溶性部分经包涵体分离、洗涤纯化。研究重组hPF4的复性条件，采用空气氧化法使重组hPF4正确重折叠。采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验观察重组hPF4的血管生成抑制活性及复性效果。结果1DNA测序证明PBV220-rhPF4表达质粒构建成功。PCR扩增得到的hPF4基因片段去除了hPF4cDNA3末端AT富含的侧翼区序列，原终止密码子TAG定位突变为原核系统强的串联终止密码子TAATAA，3端设有SalⅠ位点，5、末端设有EcoRⅠ、NcoⅠ位点，hPF4基因片段以EcoR（本文此处忽略..）Ⅰ/SalⅠ位点定向插入PBV220载体。山西医科大学2002届硕士学位论文一2DHSa／PBV220－rhPF4经温控诱导表达后，SDS－PAGE及凝胶密度扫描分析，表达产物占总国体蛋白的25－30％，凝胶迁移特性与hPF4标准品相同。Western－blotting检测表达产物与兔抗人hPF4抗体发生特异的抗原抗体反应。表明我们成功构建了hPF4原核高效表达体系。3超卢结合溶由酶法破碎人肠杆菌后，经分析rhPF4主要以包涵体的形式存＿在，包涵体经洗涤液IuOmMTrk－mPhs．趴10OmMN＊m：0．5mME0T儿ZM瞧：0．2％TritonX－1000．2％DOC）洗涤，再经洗涤液11（50mol几，PH80Tr（文章此处忽略..）k．C卜mo＊MN＊m山．5＊MEDTA：4M尿素：0．2％（Vv）Tr讨。＊x－1000．2％DOC）溶解包涵体沉淀。rhPF4纯度可达85％以上。rhPF4E透析的同时，采川立气氧化法，加以Cu‘至终浓度川”mol／1加速空气氧化，使rhPF4上确显折叠。4鸡胚绒毛尿素膜血管生成抑制实验测定复性后的rhPF4的生物学活性，初步结果显示：rhPF4具有野生蛋白抑制血管生成的活性。结论本研究运用PCR定点突变技术，完全去除了hPF4cDNA基因3”端UTRAT富含区：改用大肠杆菌强串联终止密码子TAAAATAA，成功构建高效表达克隆PBV220－rhPP4。我们构建的rhPN原核高效表达系统（此处忽略..）经m－PAGE及凝胶密度扫描分析结果表明，rhPF4表达量占菌体总蛋白量的25－30％，较原表达克隆PT7－7／rhPF4提高了近80倍，经快速高效的包涵体分高纯化工艺和复性工艺，rhPF4具有野生蛋白活性。本研究为rhPF4的结构与功能关系研究及规模化生产奠定了坚实的基础，也为真核蛋白在原核细胞中的表达调控机理提供了理论依据。

以上为本篇毕业论文范文人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究的介绍部分。

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