利用核酶自剪切机制树破HCV牢固分泌细胞模型跟小鼠模型

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利用核酶自剪切机制树破HCV牢固分泌细胞模型跟小鼠模型

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毕业论文范文题目：利用核酶自剪切机制树破HCV牢固分泌细胞模型跟小鼠模型，论文范文关键词：利用核酶自剪切机制树破HCV牢固分泌细胞模型跟小鼠模型
利用核酶自剪切机制树破HCV牢固分泌细胞模型跟小鼠模型毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体。寰球HCV的感染率约为3%,近1.7亿人感染HCV[1]。我国约为5000万人,并且年发病人数呈高速回升趋势,2009年发病人数比2003年回升了534%,达到131849人。HCV感染易慢性化[2],其慢性化率可高达70%,部分慢性丙型肝炎患者终极可发展为肝纤维化、肝硬化,甚至肝细胞癌。目前临床上重要采取烦扰素跟利巴韦林结合医治丙型肝炎,但该疗法并非对所有慢性丙型肝炎患者均有效,约50%患者不能产生持续病毒学应答(SVR),其中I型HCV感染患者SVR率最低[3,4]。因此,亟需寻找新的抗HCV药物靶点跟研制新的抗HCV药物。长期以来,因为始终缺乏有效的HCV体外培养模型跟小动物模型重大妨碍了HCV致病机制的研究、抗HCV药物体内作用后果的评估跟保护性疫苗的研发。因此摸索树破有效的HCV模型,包含HCV体外培养细胞模型跟HCV小动物模型,存在非常重要的意思。就目前国内外的研究成果来看,HCV体外培养细胞模型重要采取的是2005年日本学者Wakita等人[5]树破的体外转录模型,该模型存在操作繁琐、牢固性差等缺点,限度了它的利用。HCV小动物模型进展比较迟缓,比较成功的是人肝嵌合uPA-SCID小鼠模型[6],然而因为该小鼠出生时肝脏伤害重大,以致成活率较低,而用于移植的人肝又不易获得,这使该模型局限于少数实验室的利用,无奈满意日趋紧急的HCV研究的须要。恰是基于以上的起因,本研究树破了一种基于核酶自剪切机制的牢固分泌HCV细胞模型,并用核酶（略..）自剪切载体对HCV小鼠模型进行了摸索性研究。具体研究内容跟成果如下:1、HCV蛋白多克隆抗体的制备。根据实验的须要,原核表白六个HCV不同的蛋白片段,以表白纯化的蛋白为抗原,分辨免疫新西兰大耳白兔,收集血清,制得六个针对HCV不同蛋白片段的多克隆抗体。2、HCV核心蛋白表白载体的构建。根据实验的须要,在真核表白载体pEGFP-N1多克隆位点(MCS)前引入原核启动子lacpromoter序列,得到穿梭表白载体pEGFP-N1-lac,再把PCR扩增出的HCV核心蛋白序列(573bp)插入到构建的穿梭表白载体MCS区,得到重组质粒pEGFP-N1-lac-core,该质粒在原核细胞(E.coli)跟真核细胞(HepG2)中均能表白HCV核心蛋白,可能作为实验中HCV蛋白检测的阳性对比。3、重组质粒pJFH1/GDD-2RB的构建。利用渐变PCR的方法,在原始克隆pJFH1/GDD的HCV全长基因组cDNA的两端各参加一个核酶序列,并通过合适的酶切位点把两端含有核酶的HCV全长cDNA连接到真核表白载体pEGFP-N1的CMV启动子下游,得到目标质粒pJFH1/GDD-2RB。此外,将上述重组质粒pJFH1/GDD-2RB中HCVNS5B基因(编码产物为RNA依附的RNA聚合酶)中GDD的碱基序列渐变为GND,使表白产物失去RNA聚合酶活性,得到阴性对比质粒pJFH1/GND-2RB。4、质粒转染HepG2细胞及牢固细胞系的筛选。pJFH1/GDD-2RB及其对比质粒pJFH1/GND-2RB转染HepG2细胞（文章此处忽略..）后,参加G418溶液至终浓度为0.7mg/ml(为预实验断定的最佳筛选浓度),对转染细胞进行加压筛选。2个礼拜后,每孔均有大量细胞逝世亡,然而整合入转染质粒的细胞存活下来并决裂增殖。随后采取有限稀释法把存活下来的细胞倍比稀释铺于96孔板,最后挑取单克隆进行扩大培养,其中pJFH1/GDD-2RB牢固克隆命名为HepG2/GDD,pJFH1/GND-2RB牢固克隆命名为HepG2/GND。5、细胞培养上清中HCVRNA的检测。根据深圳匹基公司HCVPCR荧光定量检测试剂盒操作流程,提取细胞培养上清中的RNA,提取的RNA经RNase-freeDNaseI处理,以去除基因组DNA的传染。而后经过酚抽得到污浊的RNA,按照试剂盒配制25μl反应体系,利用RocheLightcycler2.0实现反应。成果显示HepG2/GDD培养上清中含有HCVRNA,参照标准品,其滴度达到1x107,阴性对比(HepG2/GND培养上清)跟空白对比(水)中均不检测到HCVRNA。6、间接免疫荧光检测HCV核心蛋白的表白。消化细胞HepG2/GDD跟原始HepG2细胞(空白对比),铺于抗原片上,待细胞贴壁后,用37℃预温的1×PBS洗3次,每次10min,而后用4%的多聚甲醛(PBS稀释)室温固定30min,洗涤(洗涤方法同上)。再用0.2%TritonX-100(PBS稀释)浸泡5min以加强细胞膜的通透性,洗涤。用山羊血清室温封闭固定好的细胞30min,PBS荡涤后,参加1:400稀释的抗HCV核心蛋白单抗,37℃孵育1h,洗涤,参加1:1000稀释的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠IgG,（文章此处忽略..）37℃避光孵育1h,洗涤后参加含有DAPI(4',6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)的封片剂,荧光倒置显微镜下察看到HepG2/GDD细胞胞浆区域有较强荧光呈现,而空白对比则无此景象,由此表明,HepG2/GDD细胞中有HCV核心蛋白表白。7、蛋白免疫印迹检测HCV核心蛋白的表白。收集HepG2/GDD跟原始HepG2细胞,裂解缓冲液裂解后离心取上清,按照4:1的体积比参加5倍上样缓冲液,沸水浴15分钟。上样进行SDS-PAGE电泳,之后转至PVDF(聚偏氟乙烯膜)膜上,5%脱脂牛奶37℃封闭2h,抗HCV核心蛋白单抗4℃孵育过夜,HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG37℃孵育1h,ECL显色,暗室内曝光于胶片上,察看到HepG2/GDD泳道有条带产生,大小与阳性对比类似,而空白对比(HepG2细胞)无条带浮现。8、HCV病毒颗粒的电镜察看。收集HepG2/GDD细胞培养上清(约15ml),缓缓搅动并参加NaCl至终浓度0.5mol/L,再参加PEG6000至终浓度为10%,4℃过夜。8000rpm离心30min,收集积淀,溶于100μlPBS中。用细滴管汲取一滴样品悬液,滴于铜网上,进行负染操作。实现负染后,置于电子显微镜(Philips,TECNAI-10)下,察看到HCV颗粒,直径约为55nm。9、烦扰素医治。把HepG2/GDD细胞铺于6孔细胞培养板中,参加不同剂量的IFN-α至终浓度为10U/ml、100U/ml、500U/ml。3d后收集细胞上清,提取RNA,实时定量PCR检测病毒滴度,发明病毒滴度随烦扰素浓度升高而降落,预示该细胞模型可能用来抗HCV药物的筛选。10、HC（文章此处忽略..）V转染小鼠模型摸索研究。通过高压水能源法把质粒转染入C57小鼠肝脏细胞,3天后处死小鼠,收集血清并取肝。用实时定量PCR的方法不检测到血清中含有HCVRNA,免疫组化检测小鼠肝脏中HCV核心蛋白发明,在血管四周细胞中有HCV核心蛋白表白。通过上述一系列的研究,咱们成功构建了质粒pJFH1/GDD-2RB,通过把该质粒转染HepG2细胞,而后G418加压筛选,获得了整合有该质粒的细胞系HepG2/GDD,该细胞系可能有效表白HCV核心蛋白,实时定量PCR检测上清液中HCV滴度达到1×10~7,电镜察看HCV直径为55nm。利用经IFN-α医治发明上清液中病毒滴度随烦扰素-α浓度的升高而降落。在随后发展的HCV转染小鼠模型摸索研究中发明,小鼠血清中不HCV颗粒,然而免疫组化证明,小鼠肝细胞中有HCV核心蛋白的表白,这为咱们深刻发展小鼠模型研究打下良好的基本。

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