重组双功能域人补体受体1型分子的构建及其生物功能分析

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重组双功能域人补体受体1型分子的构建及其生物功能分析

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毕业论文范文题目：重组双功能域人补体受体1型分子的构建及其生物功能分析，论文范文关键词：重组双功能域人补体受体1型分子的构建及其生物功能分析
重组双功能域人补体受体1型分子的构建及其生物功能分析毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：补体系统的异样适度活化是缺血再灌注伤害、异种器官移植急性排斥反应等很多炎症性疾病的产生跟发展的重要始动因素之一。血清补体克制程度的降落会导致溶尿综合症、阵发性睡眠性血红蛋白尿、肾小球肾炎及遗传性血管源性水肿等疾病的产生。克制补体的适度活化是医治这些疾病的一个新的思路。补体活化有经典、旁路跟甘露糖结合凝集素(MBL)三条道路,但这三条道路都在C3处汇合。补体1型受体(complementreceptortype1,CR1)可能结合C3b跟C4b,存在加速C3/C5转化酶裂解的加速衰变活性(decay-acceleratingactivityDAA)跟帮助I因子裂解C3b跟C4b的帮助因子活性(co-factoractivityCA)。因为CR1是一个多能有效的补体克制剂,因此在CR1基本上研制补体克制剂是一个非常公道的策略。因为CR1中的内在同源性,在除羧基端2个SCRs外的28个SCRs构成4个大的长同源反复(longhomologyrepeatLHR),每个由7个SCRs组成。分辨称为LHRA、LHRB、LHRC跟LH（略..）RD。其中,LHRA中的前3个SCRs组成有功能性位点Ⅰ,而LHRB跟LHRC中的前3个SCRs组成的位点只有三个氨基酸的不同,有雷同的功能,都称为功能性位点Ⅱ。位点Ⅰ可能结合C4b,而结合C3b的才能非常幽微,对C3转化酶有很高的加速衰变活性,但帮助I因子裂解C3b跟C4b的才能比较弱。位点Ⅱ可能有效地结合C3b跟C4b,结合C4b的才能比结合C3b的才能弱。位点Ⅱ对C3b跟C4b有很高的CA活性,但对C3转化酶的DAA活性比较低,因此可能说一拷贝的加速衰变因子(decay-acceleratingfactorDAF)样位点跟2个拷贝的膜帮助蛋白(membranecofactorproteinMCP;CD46)样位点使CR1成为补体活化调节剂(regulatorsofcomplementactivationRCA)家族中独一的可能失活裂解全部4种C3跟C5转化酶的多功能性分子。实验表明,只管LHRA对C3转化酶有足够的DAA活性,但对C5转化酶的DAA活性较低,要使LHRA对C5转化酶存在较好的DAA活性,其后必须跟包含有（文章此处忽略..）位点Ⅱ的LHRB或LHRC。LHRB或LHRC的作用是结合三聚体的C5转化酶中的C3b。本研究从CR1分子的构造跟功能出发,利用重叠延长PCR(splicingoverlapextentionPCR,SOE-PCR)的方法构建出可能结合C3b跟C4b的双功能域CR1衍生物,并在原核体系中进行表白并验证了其活性,为新型补体克制剂的进一步研制奠定基本。研究获得了以下重要成果:1.从人外周血单个核细胞中提取总RNA,经RT-PCR成功地克隆了编码人补体受体Ⅰ型胞外区CR1-SCR1-3的cDNA(其长度为585bp),连接于pMD18-Tsimple载体后测序,序列比对发明与GenBank上登录的编码相应补体受体Ⅰ型cDNA区域序列一致。2.以构建的含功能性片段Ⅰ的T载体为模板,扩增出平端的功能性位点Ⅰ;以本室构建的pET32a-CR1-SCR15-18为模板扩增出平端的功能性片段Ⅱ(CR1-SCR15-17);利用重叠延长PCR方法扩增出包含双功能域的融合基因。将融合基因重组于pET32a(+)载体,成功地构建了双功能域的重组原核表白质粒,命名（本文此处忽略..）为pET32-CR1-2D。氨苄青霉素筛选出阳性重组质粒经酶切及序列测定确认。3.将构建的pET32-CR1-2D载体成功转入大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG引诱表白,SDS-PAGE分析发明在分子量约63kDa处呈现一条明显表白条带;其以包涵体情势表白;并确破pET32-CR1-2D在37℃前提下,1mmol/LIPTG引诱4h时,大肠杆菌中有较高的蛋白表白程度。采取抗6×His抗体经Westernblot进一步证明了此蛋白。4.蛋白经Ni-NTA柱纯化后,可得到单一条带的蛋白,表明采取亲跟层析可实现Txr-CR1-2D蛋白的一步纯化。透析复性实验发明尿素浓度梯度逐步递减复性后果较好,最佳复性前提为:透析液中谷胱甘肽氧化型为1.5mmol/L、还原型为3.5mmol/L时析出蛋白较少,且补体溶血克制实验表明此时生物活性较好;透析复性后的蛋白经肠激酶酶切,及随后Ni-NTA纯化后,可获得不含外源氨基酸的重组CR1-2D蛋白。5.体外功能实验验证了重组蛋白的活性。体外免疫介导红细胞溶解实验模型中,分光光度计方法测定上清中（本文此处忽略..）血红蛋白发明该蛋白可能克制红细胞溶解;流式细胞术的方法发明重组蛋白可能减少红细胞名义C3b沉积;ELISA方法发明重组蛋白可能减轻上清中C5a产生。这些指标必定程度上阐明了CR1-2D有克制血管内溶血跟血管外溶血的才能。在小鼠体内树破免疫介导红细胞溶解模型,流式细胞术的方法察看了输注红细胞在不同时相点存活情况。证明了该重组蛋白在标记红细胞输注的两小时内可能延长红细胞的存活时光。综上所述:本实验成功的构建了由位于LHRA内的功能性片段Ⅰ跟位于LHRC内的功能性片段Ⅱ组成的双功能域的重组CR1分子,体内外功能实验验证了其生物学活性。咱们的实验成果表明该重组双功能域蛋白研制开发新型补体克制剂奠定了良好的基本。

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