PRAK彼此作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK彼此作用的研究

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PRAK彼此作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK彼此作用的研究

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毕业论文范文题目：PRAK彼此作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK彼此作用的研究，论文范文关键词：PRAK彼此作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK彼此作用的研究
PRAK彼此作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK彼此作用的研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：p38丝裂原蛋白激活激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是一种应激激活的丝／苏氨酸蛋白激酶，属于MAPK超家族；目前已发明p38MAPK家族成员有p38α、p38β、p38γ、p38δ，分子量约38～40kD。各个亚型之间的不同功能部分与它们在不同组织的表白，激活方法以及底物特异性相干，不同的p38能被细胞应激(紫外线辐射、浸透性休克、热休克、脂多糖、蛋白合成克制剂)、某些细胞因子如IL-1、TNF-α等激活。细胞应激或细胞名义受体与配体的结合介导p38的激活是一种由特定的激酶通过一种高度保守的三级激酶模式(MKKK／MKK／MAPK)而激活的过程。p38是在苏氨酸(threonine，Thr)-甘氨酸(glycine，Gly)-酪氨酸(tyrosine，Tyr)活化基团中Thr跟Tyr双位点上被磷酸化而激活。能磷酸化激活p38的蛋白激酶有丝裂原激活蛋白激酶激酶3(mitogen-activatedproteinkinasekinase3，MKK3)跟MKK6。这两种MKK都能被转化成长因子β激活激酶1(transforminggrowthfactor-β-activatedkinase1，TAK1)、凋亡信号通路调控激酶1(apoptosissignal-regulatingkinase1，ASK1)、含SH3构造域富含脯氨酸的蛋白激酶(Srchomologydomain3-containingproline-richproteinkinase，SPRK)、p21激活激酶(p21-activatedkinase，PAK)等激活。p38被激活后将磷酸化一些特异性底物，包含多种转录因子，如转录激活因子2(activatingtranscriptionfactor2，ATF2)、C／EBP-β跟C／EBP同源蛋白10(C／EBPbetaandC／EBP-homologousprotein10，CHOP10)、肌细胞结合加强因子2C(myocyteenhancerbindingfactor-2C，MEF2C)、Myc相干因子x(Myc-associatedfactorX，Max)，蛋白激酶，如MAPK激活蛋白激酶2(mitogen-activatedproteinkinase-activatcdproteinkinase2，MAPKAPK2)跟M（本文此处忽略..）APKAPK3、p38调控激活蛋白激酶(p38-regulated／activatedproteinkinase，PRAK)、MAPK作用激酶1(MAPkinaseintegratingkinase,，MNK1)跟MNK2等。因为p38能磷酸化很多不同的底物，因此有理由认为p38存在很多不同的生物学功能。p38MAPK的激活波及到细胞成长、细胞周期、细胞凋亡等过程。同时，也波及到炎症跟应激反应的调控、转录因子的调控、细胞骨架重组等，在多种疾病过程都发挥重要作用，如在心肌肥大、缺血／再灌注伤害、神经元病理、感染性疾病、创伤愈合跟组织重塑中等。PRAK是一个受p38调控的丝氨酸／苏氨酸激酶，由471个氨基酸组成，分子量约54kD；有关PRAK的功能研究目前存在着一些争议，一些研究认为在细胞应激跟致炎因子的刺激下，细胞中的PRAK能被p38磷酸化激活，被激活的PRAK转而磷酸化激活小分子量热休克蛋白27(heatshockprotein27，HSP27)，从而介导细胞骨架重构，参加细胞应激反应。但近年来，另一些研究发明PRAK可能被非典范的MAPK家族成员ERK3磷酸化激活，而p38α／β对PRAK的磷酸化激活只有当p38跟PRAK都在哺乳动物细胞中适度表白时才会产生。这一成果提示，PRAK在体内可能参加了ERK3信号传导通路，而在畸形生理状况下p38可能并不是PRAK的上游调控激酶。另外，有关HSP27是否是PRAK的底物，目前也存在着争议，有研究发明重组的GST-PRAK在体外固然能被p38激活并磷酸化HSP27，但通过免疫共积淀得到的内源性PRAK在体外并不能磷酸化HSP27。在受到NaAsO_2刺激的野生型跟PRAK缺点型细胞中，都能检测到相近程度的HSP27的激活，提示HSP27在细胞内的激活可能并不完全受PRAK的调控。因此HSP27是否是PRAK的底物以及PRAK的底物到底有那些蛋白还须要进一步的研究证明。内源性PRAK重要定位于胞质中；而外源性表白的PRAK则重要位于细胞核中。序列分析表明，PRAK同时含有一个核输出信号(nuclaerexportsequence，NES)跟一个核定位信号(nuclearlocalizationsequence，NLS)，而这两者对PRAK的穿梭而言是必不可少的。在受到刺激后，因为P（略..）RAK入核减少而出核增加，导致核中的PRAK减少。PRAK的入核不依附于p38的激活，但出核则依附于p38对其磷酸化。因此，PRAK的亚细胞分布由多种因素决定，而且PRAK在胞质与胞核之间的穿梭到底介导哪些细胞功能也不明白。可能看出，p38MAPK信号通路存在广泛跟复杂的生物学功能，PRAK作为该通路中的重要成员始终是研究的热点。但目前咱们对其意识还非常有限，并且在很多问题上还存在着一些争议。为了进一步研究PRAK的功能，及其可能的下游底物跟上游激酶，咱们利用酵母双杂交筛选体系筛选了与PRAK相结合的蛋白。酵母双杂交是研究蛋白质彼此作用的重要方法跟手段。该方法的基本原理是利用转录激活因子(transcriptionactivator，TA)的DNA结合构造域(DNA-bindingdomain，BD)跟DNA激逝世构造域(DNA-activatingdomain，AD)可能分为两个空间上彼此独破的功能单位这一特点，将“钓饵”蛋白与BD相融合，将可能与之彼此作用的蛋白或被筛选的文库与AD融合。假如两者之间在酵母细胞内有彼此作用，即便AD跟BD在空间上彼此凑近，启动下游的报告基因。目前这一体系被广泛利用于文库筛选、蛋白质彼此作用鉴定以及蛋白质彼此作用的构造域鉴定等方面。比拟于其余方法，酵母双杂交体系存在更能模仿真核细胞内的作用环境、敏感性高、特异性好、高效等特点；而且经改进后的一些双杂交体系还能利用于膜蛋白之间彼此作用、转录后润饰的蛋白质之间彼此作用的验证，以及蛋白复合体之间彼此作用的验证等。经过筛选，咱们共得到3个可能与PRAK结合的蛋白，分辨是MASP1(homosapiensmannan-bindinglectinserineprotease1)、SEPT8(homosapiensseptin8)跟DJ-1。DJ-1基因是由DaisukeNagakubo等人在1997年发明的一种新的丝裂原依附性癌基因，其编码的DJ-1蛋白可能协同Ras蛋白引起小鼠NIH3T3细胞的转化。该蛋白广泛表白于人体各种组织，尤其在睾丸、前列腺、骨骼肌、肾脏、心脏、肝脏等组织中，表白量较高，并以二聚体的情势参加细胞的多种生福气动，如肿瘤产生、受精、雄激素受体调控、分子伴侣、抗氧化以及调控（本文此处忽略..）RNA结合复合体与RNA的结合等。已经有文献报道PRAK可能被H_2O_2刺激激活，并且参加了人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)在氧应激时应力纤维的构成。而DJ-1在氧化应激时，能通过“表演”分子伴侣、清道夫蛋白以及以至凋亡通路等多种方法有效地保护细胞抵抗氧自由基的伤害。在克制细胞凋亡方面，DJ-1重要是通过与细胞核中Fas逝世亡构造域相干蛋白(Fasdeathdomain-associatedprotein，Daxx)蛋白结合，克制其出核，阻断下游激酶ASK1的激活，终极克制凋亡道路。但DJ-1序列中并不NLS，因此DJ-1如何入核始终是一个迷。根据前期研究跟咱们筛选的成果，咱们提出了对于DJ-1与PRAK的假想，即在氧化应激时，细胞内的PRAK跟DJ-1会被激活，表白量上调，这时胞浆中的部分DJ-1就会与PRAK结合，并被PRAK通过某种方法携带入细胞核，进入细胞核的DJ-1就能与核内的Daxx蛋白结合并克制其进入胞浆，使得胞浆中的ASK1激酶不能被激活，终极起到克制细胞凋亡，保护细胞的抗氧化的功能。假如上述假设可能得到证明，对有关DJ-1跟PRAK的功能研究存在重要意思，并且可能以DJ-1跟PRAK为切入点将p38信号通路与细胞凋亡道路接洽起来。为此咱们对DJ-1的定位、移位、抗氧化应激功能跟DJ-1与PRAK的彼此作用进行了初步研究，成果发明DJ-1与PRAK在体外可能特异性地结合。随后，咱们通过绿色荧光蛋白示踪的方法发明，在畸形情况下，DJ-1在细胞的胞浆、胞核都有表白，但以胞浆居多；在血清以及H_2O_2刺豪情况下部分细胞中的DJ-1会从胞浆移位到胞核，这初步证明了咱们对于DJ-1在氧化应激的情况下会入核的假设。免疫荧光发明，HA-PRAK跟pEGFP-DJ-1在部分NIH3T3细胞的胞核中存在共定位，揣测PRAK与DJ-1的共定位与细胞周期有关，因为有文献报道，DJ-1的在血清刺激下的入核与细胞周期有关。咱们还发明，当跟HA-PRAK共转时，胞核中EGFP-DJ-1的表白量有必定程度的升高，这一景象进一步被核质分别实验所证明，这提示DJ-1跟PRAK在胞核中存在彼此作用。然而Flag-DJ-1与HA（文章此处忽略..）-PRAK在NIH3T3以及HEK293细胞中的免疫共积淀未能测到阳性成果，这可能与咱们所揣测的PRAK与DJ-1仅在细胞周期的某一特定时代，才在细胞核内有共定位有关，因此咱们还须要进一步改进实验方法跟前提，以获得确切的实验成果。最后咱们将HEK293细胞转染pcDNA3-Flag-DJ-1作为实验组，转染pcDNA3-Flag空载体跟不转染组作为两个阴性对比，采取不同浓度的H_2O_2刺激24h，通过MTT检测发明，与两个对比组比拟，在200～600μmol／L浓度的H_2O_2范畴内，pcDNA3-Flag-DJ-1转染组的细胞活力明显较好，提示在该H_2O_2浓度刺激范畴内，Flag-DJ-1能有效地保护细胞抵抗氧化应激。综上所述，咱们利用酵母双杂交筛选体系，以PRAK为靶蛋白，筛选了人心脏cDNA文库，得到3个可能与其彼此作用的蛋白，为下一步深刻研究PRAK功能跟调节机制提供新的切入点；同时将筛选到的一个可能与PRAK有结合的蛋白DJ-1，克隆到真核以及原核表白载体上，做了体内、体外的结合实验，证明两者在体外可能特异性结合；并在NIH3T3细胞核中存在共定位，适度表白的PRAK还可能影响DJ-1的亚细胞定位，促进DJ-1移位入核。最后，还对DJ-1在真核细胞中的表白定位及与应激刺激关联作了初步探讨，发明在静息状况下，DJ-1弥散分布在细胞的胞浆、胞核，但以胞浆为主。在受到血清以及H_2O_2刺激当前，部分细胞中的DJ-1会从胞浆移位到胞核。最后咱们还通过XTT实验证明，在200-600μmol／L浓度范畴内的H_2O_2刺激下，DJ-1能有效地保护细胞抵抗氧化应激。

以上为本篇毕业论文范文PRAK彼此作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK彼此作用的研究的介绍部分。

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