伪狂犬病毒Ea株重要衣壳蛋白之间的彼此作用研究

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伪狂犬病毒Ea株重要衣壳蛋白之间的彼此作用研究

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毕业论文范文题目：伪狂犬病毒Ea株重要衣壳蛋白之间的彼此作用研究，论文范文关键词：伪狂犬病毒Ea株重要衣壳蛋白之间的彼此作用研究
伪狂犬病毒Ea株重要衣壳蛋白之间的彼此作用研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies)又称奥耶斯基氏病(Aujeszky'sdisease,AD),是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的包含多种牲畜跟野活泼物共患的一种急性感染病。伪狂犬病毒基因组全长约150kb,可编码70-100种蛋白,与α-疱疹病毒亚科的其它成员一样,PRV存在埋伏感染跟神经嗜性等特点。PRV病毒粒子构造与其它疱疹病毒类似,成熟的病毒粒子由四种构造组成:核心的核含有病毒的线性双链DNA基因组,DNA被包裹在起保护作用的二十面体衣壳中构成核衣壳,衣壳再嵌入到间质构造中,终极在间质外包裹囊膜。多少乎PRV所有基因产物的一半都是成熟病毒粒子的结构成分。目前,对于PRV衣壳蛋白的研究都是从HSV-1病毒粒子的研究中揣测出来的,揣测PRV的衣壳为二十面体构造(150个六邻体跟12个五邻体)。其中六邻体含有6个UL19分子跟6个UL35分子,构成衣壳边沿跟名义;12个五邻体构成衣壳顶角,有11个五邻体是UL19的五聚物,仅第12个顶角是由12个UL6分子构成的圆柱形构造,仅容许一个拷贝的病毒DNA基因组进入衣壳。因此,每一个成熟的衣壳含有955个UL19(VP5)分子、900个UL35(VP26)分子、640个UL18分子(VP23)、320个UL38分子(VP19C)跟12个UL6分子(接入蛋白)。衣壳在细胞核中装配,须要六种成熟衣壳的蛋白(UL38、UL35、UL25、UL19、UL18、UL6)跟两种框架蛋白(UL26、UL26.5),（本文此处忽略..）这两种框架蛋白参加构成衣壳但并不存在于成熟的衣壳中。鉴于以上研究背景,本研究对PRV衣壳的构成的机制,衣壳的包装、成熟跟牢固进行了摸索,研究了衣壳蛋白之间的彼此作用。重要研究内容如下:1.PRVEa株UL6、UL18、UL19、UL25、UL26、UL26.5、UL35、UL38的克隆以及序列分析以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,分辨PCR扩增UL6、UL18、L25、UL26、UL26.5、UL35、UL38,克隆到pMD18-T载体,并测序。测序成果表明Ea株UL6、UL18、L25、UL26、UL26.5、UL35、UL38基因全长分辨为1938bp、891bp、1605bp、1599bp、861bp、312bp、1107bp,分辨编码646、297、535、533、287、104、369个氨基酸,与PRVKa株核苷酸同源性分辨为98%、98%、99%、97%、95%、99%、98%,氨基酸同源性分辨为97%、98%、99%、97%、95.8%、99%、99%。UL19采取分段克隆,扩增UL19上游368bp,下游600bp的碱基,并酶切PRVEa基因组,回收BamHⅠ第4片段,并进一步酶切构建重组质粒,获得pShuttle-UL19。2.PRVEa株衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表白及亚细胞定位分析将UL6克隆到原核表白载体pET-28a,获得原核表白质粒pET-28a-UL6,转化大肠杆菌BL21,经IPTG引诱3h后,经12%SDS-PAGE跟Western印迹分析在70kDa处呈现一条特异性杂交带,表明融合蛋白6×His-UL6存在良好的反应活性。同理,分析融合蛋白6×His-UL18大小为33kDa,GS（文章此处忽略..）T-UL26.5为56kDa,6×His-UL38为40kDa。进一步将UL6基因亚克隆到真核表白载体pEGFP-C2,获得真核重组表白质粒pEGFP-UL6。同理,构建pEGFP-UL18、pEGFP-UL19、pEGFP-UL25、pEGFP-UL26、pEGFP-UL26.5、pEGFP-UL35跟pEGFP-UL38,并将获得的表白质粒分辨转染HeLa细胞,在转染后48h通过激光共聚焦显微镜察看荧光,成果显示对比质粒pEGFP-C2转染的细胞在全部细胞中都可见弥散型的绿色荧光分布,且在转染后始终呈弥散型分布;融合蛋白EGFP-UL6定位于细胞质,EGFP-UL18、EGFP-UL26.5以及EGFP-UL38在转染后48h多少乎完全定位于细胞核内,而EFGP-UL19、EGFP-UL25、EGFP-UL26、EGFP-UL35转染后始终不明显的变更,呈弥散型分布。3.哺乳动物双杂交检测PRVEa株衣壳蛋白基因之间的彼此作用pMD-UL18经BamHⅠ跟KpnⅠ酶切后,分辨插入哺乳动物双杂交表白载体pACT与pBIND的雷同酶切位点,获得重组pACT-UL18与pBIND-UL18,同理获得pACT-UL19等14个重组质粒。将pACT分辨与pBIND、pBIND-UL6、pBIND-UL18、pBIND-UL19、pBIND-UL25、pBIND-UL26、pBIND-UL26.5、pBIND-UL35、pBIND-UL38:（略..）pBIND分辨与pACT-UL6、pACT-UL18、pACT-UL19、pACT-UL25、pACT-UL26、pACT-UL26.5、pACT-UL35、pACT-UL38共转染CHO细胞,48h后收集细胞,裂解后采取双荧光报告体系检测,成果显示pACT与pBIND-UL19,pACT与pBIND-UL25,pBIND与pACT-UL26.5存在自激活。根据自激逝世成果,将构建的哺乳动物双杂交表白质粒两两之间共转染CHO细胞,48h收集细胞,用裂解液充决裂解后双荧光报告体系检测荧光素比值,成果显示UL18与UL38,UL19与UL26.5,UL26.5与UL26之间存在彼此作用。4.GSTPull-Down跟免疫共积淀实验验证PRVEa株衣壳蛋白的彼此作用将大肠杆菌表白的UL26.5蛋白与重组杆状病毒rBacUL19感染Sf9细胞48h收集的裂解液,采取GSTPull-Down验证,显示在140kDa可能看见一条特异性条带,是重组杆状病毒rBacUL19的表白产物,阐明UL19与UL26.5之间存在彼此作用。构建哺乳动物表白质粒pCMV-HA-UL18、pCMV-Myc-UL18、pCMV-HA-UL38以及pCMV-Myc-UL38,将HA-UL18与Myc-UL38,以及HA-UL38与Myc-UL18在脂质体介导下共转染HeLa细胞,48h后裂解细胞,免疫印迹分析UL18与UL38的作用,在HA-UL18与Myc-UL38共转染的细胞裂解液,用（略..）HA多抗积淀的产物,利用Myc单抗可能检测到UL38的表白;而在HA-UL38与Myc-UL18共转染的细胞裂解液,用HA多抗积淀的产物,利用Myc单抗可能检测到UL18的特异性表白条带,验证UL18与UL38之间存在彼此作用。

以上为本篇毕业论文范文伪狂犬病毒Ea株重要衣壳蛋白之间的彼此作用研究的介绍部分。

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