蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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毕业论文范文题目：蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定，论文范文关键词：蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起的反刍动物虫媒传染病。BTV能感染大多数家养的和野生的反刍动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。不同流行地区易感动物的死亡率差别很大，一般都可达到30%，在某些地区甚至更高。BT血清型众多，目前已发现24个血清型，最近又相继分离到BTV25和26型。自2006年BTV8在欧洲许多国家爆发，造成了严重的经济损失。我国目前还未有BTV8流行的相关报道，但是随着国际贸易的往来，BTV8随时有可能传入我国。所以，必须加强我国BT尤其是BTV8的相关工作的研究，做好必要的技术储备。由L2基因编码的VP2蛋白是BTV血清型的主要决（本文此处忽略..）定性抗原。根据Genbank中已登录的BTV8L2基因序列（登录号：AJ585129）设计1对引物，从感染BTV8的BHK-21细胞上清提取病毒RNA，经RT-PCR扩增L2基因。经双酶切将L2基因克隆至原核表达载体pMAL-C4X，构建重组质粒pC4X-VP2。将pC4X-VP2转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达，诱导产物经SDS-PAGE分析，结果显示重组VP2蛋白在原核表达系统中得到大量表达，WesternBlot结果显示VP2蛋白与MBP（Maltose-bindingprotein）标签实现了融合表达，但大部分以包涵体的形式存在，通过切胶对其进行了纯化，制备免疫原。经双酶切将L2基因克隆至真核表达供体质粒pFastBa（略..）cHTA载体上，构建重组供体质粒pFast-VP2。将重组供体质粒pFast-VP2转化DH10Bac感受态细胞，从中分离出重组杆粒BAC-VP2，将重组杆粒BAC-VP2转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒BACV-VP2。经SDS-PAGE分析表明VP2蛋白在昆虫细胞Sf9得到表达，主要以包涵体形式存在。通过包涵体纯化方法对其进行了纯化，制备检测抗原。以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原免疫5-6周龄BALB/c小鼠，通过体外细胞融合技术将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫后BALB/c小鼠的脾细胞进行融合。以真核表达的重组VP2蛋白为检测抗原，通过间接ELISA方法筛选出2株能稳定分泌VP2蛋白单克隆抗体（Monoclonalanti（本文此处忽略..）body,Mab）的杂交瘤细胞，分别命名为BTV8VP2-3E11和BTV8VP2-4D9，简称为3E11和4D9。WesternBlot结果表明2株Mabs都可与BTV8在BHK-21细胞中表达的VP2蛋白发生特异性反应；IFA结果表明2株Mabs都可与BTV8发生特异性反应，与其他血清型呈阴性反应，为建立BTV8鉴别诊断方法奠定了基础。根据重组质粒pC4X-VP2基因序列设计24对引物，分别将PCR产物克隆至原核表达载体pMAL-C4X，构建重组质粒pMAL-VP2-1﹣pMAL-VP2-24，分别转化至EcoliBL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达，每两条相邻的短肽重叠10-13个氨基酸。通过肽扫描技术初步确定3E11和4D9抗原表位的范围，再利用合成肽技术合成连续重叠的短肽（本文此处忽略..），通过肽扫描技术确定3E11抗原表位为~(99)HSEFHTKSNWVQW~(111)，4D9抗原表位为~(622)AQYVFEKTCLYVLE~(635)。利用Blast对3E11和4D9的抗原表位进行氨基酸序列比对发现在不同地域来源的BTV8毒株都是非常保守的。上述结果有利于进一步了解BTV8VP2蛋白的抗原结构及其在免疫应答中的作用，也有利于合成肽疫苗的研制。

以上为本篇毕业论文范文蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定的介绍部分。

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