耻垢分枝杆菌MSMEG_5243及MSMEG_6086基因的克隆、过表达与功能鉴定

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耻垢分枝杆菌MSMEG_5243及MSMEG_6086基因的克隆、过表达与功能鉴定

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毕业论文范文题目：耻垢分枝杆菌MSMEG_5243及MSMEG_6086基因的克隆、过表达与功能鉴定，论文范文关键词：耻垢分枝杆菌MSMEG_5243及MSMEG_6086基因的克隆、过表达与功能鉴定
耻垢分枝杆菌MSMEG_5243及MSMEG_6086基因的克隆、过表达与功能鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)属于分枝杆菌属,是引起结核病的病原体。其细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础,核心结构mAGP(Mycolicacid-Arabinogalactan-Peptidoglycan)由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三部分。聚阿拉伯半乳糖为连接肽聚糖和分枝菌酸、维持细胞壁结构完整性的重要组分,并且组成聚阿拉伯半乳糖的阿拉伯糖为D型糖,而哺乳动物不存在这种D型糖,所以聚阿拉伯半乳糖可作为研发新一代抗结核药物的理想靶标。耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatics,M.smegmatis)也属于分枝菌属,与结核分枝杆菌具有同源性,相似的细胞壁,且无致病性。辛毅教授在1996年于耻垢分枝杆菌中发现了一种内源性的能降解聚阿拉伯半乳（略..）糖的聚阿拉伯糖的水解酶。能够破坏细胞壁的完整性,是潜在的抗结核药物的选择。大连医科大学董旭完成了对该酶的纯化,并用质谱对纯化的蛋白进行了分析,通过生物信息学,找到了该酶的候选基因并进行了初步的分析。在前面工作的基础上,选择了两个候选基因MSMEG_5243和MSMEG_6086,通过克隆和过表达,来确定此两候选基因是否与内源性聚阿拉伯糖水解酶有关。本论文的目的是(1)克隆耻垢分枝杆菌基因MSMEG_5243及MSMEG_6086(2)耻垢分枝杆菌和大肠杆菌中过表达基因MSMEG_5243及MSMEG_6086(3)确定基因MSMEG_5243和MSMEG_6086的表达产物是否具有聚阿拉伯糖水解酶活性本论文的方法及结果是：1.PCR扩增基因MSMEG_5243和MSMEG_6086,DNA序列测定正确后构建克隆载体pMD18-MSMEG_5243和pMD18-MSMEG_6086.2.构建用于耻垢分枝杆（本文此处忽略..）菌表达的表达载体pVV2-MSMEG_5243和pVV2-MSMEG_6086以及用于大肠杆菌表达的表达载体pET16b-MSMEG_5243和pET16b-MSMEG_6086并且分别转化到表达菌株M.smegmatismc2155和BL21(DE3)中。3.SDS-PAGE和Westernblotting检测基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的蛋白表达,显示MSMEG_5243和MSMEG_6086在M.smegmatismc2155和BL21(DE3)中均过表达4.Ni-NTA-Agarose柱层析纯化在大肠杆菌中过表达的蛋白。SDS-PAGE和Westernblotting检测到了纯化的基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的过表达蛋白。5.鉴定目的蛋白的活性(1)HPLC检测过表达目的基因的耻垢分枝杆菌的细胞壁阿拉伯糖变化,相比于野生型耻垢分枝杆菌的阿拉伯糖的量,过表达基因MSMEG_5243及（文章此处忽略..）MSMEG_6086的细胞壁阿拉伯糖的量未发生明显的变化。(2)扫描电镜观察过表达目的基因的耻垢分枝杆菌的形态学变化,耻垢分枝杆菌一般成棒状,相比于野生型的耻垢分枝杆菌的形态,过表达基因MSMEG_5243的菌株形态个别发生改变,而过表达基因MSMEG_6086的菌株形态没有发生变化。(3)分光光度法检测过表达目的基因的耻垢分枝杆菌的生长状况,绘制生长曲线,相比于野生型的耻垢分枝杆菌的生长,过表达基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的菌株生长速度都有所减慢。(4)酶活性测定,将大肠杆菌中表达的基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的蛋白与底物聚阿拉伯半乳糖反应后,用bio-gelA1.5M凝胶过滤层析法和苯酚硫酸法对反应后的产物进行检测,没有检测到聚阿拉伯糖水解酶的活性。本论文的结论是：本论文利用分子克隆技术克隆了耻垢分枝杆菌的基因MSM（略..）EG_5243及MSMEG_6086基因,并在耻垢分枝杆菌和BL21(DE3)中过表达了两基因。探讨了过表达蛋白与聚阿拉伯糖水解酶的关系,从实验中未能检测出过表达蛋白的聚阿拉伯糖水解酶的活性。但是为更进一步探讨两蛋白与聚阿拉伯糖水解酶的关系提供了一定的依据,并对寻找真正的聚阿拉伯糖水解酶有一定的借鉴意义。

以上为本篇毕业论文范文耻垢分枝杆菌MSMEG_5243及MSMEG_6086基因的克隆、过表达与功能鉴定的介绍部分。

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