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慢性肾衰增加脂肪组织脂质分解

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毕业论文范文题目：慢性肾衰增加脂肪组织脂质分解，论文范文关键词：慢性肾衰增加脂肪组织脂质分解
慢性肾衰增加脂肪组织脂质分解毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：研究背景脂肪细胞脂质分解过程与体内脂肪分布及代谢健康密切相关,脂肪细胞分解产生的游离脂肪酸(FFA)是外周组织能量需求时如禁食,运动等情况下的重要燃料。此外,释放的FA也可以调节葡萄糖和胰岛素的活性和产生,参与胰岛素抵抗发生发展。因此,脂肪细胞脂质分解不仅调节能量平衡和脂肪分布,脂质分解的正常调节对于代谢健康也是至关重要的。脂质分解异常与人类多种疾病如代谢综合症、胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病等密切相关.许多慢性消耗性疾病常有蛋白质-能量消耗(PEW)和脂肪组织的减少,蛋白质能量消耗(PEW),主要表现为体内蛋白质和脂肪储存的减少,以营养不良和炎症为特征,在进展性慢性肾疾病(CKD)中常发生,是CKD病人死亡率增加的重要危险因素。有关PEW中的蛋白质消耗研究甚广,认为机体酸中毒,胰岛素抵抗以及炎症状态等活化机体泛素-蛋白酶通路增加蛋白质的分解代谢。虽然体内脂肪的丢失也是CKD病人死亡率增加的一个独立危险因素,但是脂肪量减少的具体机制目前尚不清楚.已有研究表明慢性肾功能不全可引起肾周,网膜,肠系膜以及腹部脂肪组织重新分布异位沉积至脂肪组织以外的组织器官,如心,血管,肝,胰腺等,可引起Ⅱ型糖尿病以及心血管疾病等的发生发展。脂肪细胞是储存和释放甘油三酯的主要场所,当脂肪细胞摄取以及存储脂质的功能受损时便可引起脂质的异位沉积。以上资料表明,慢性肾衰存在脂质存储和动员异常,但具体的机制尚没有相关研究。代谢综合症的病人以及糖尿病患者常有晚期氧化蛋白产物(AOPPs)的沉积。AOPPs是一种与细胞内氧化应激及炎症反应密切相关的尿毒症大分子毒素,1996年由Witko-Sarsat等在CRF病人血浆中首次发现并命名。它是氧化应激过程中由激活的中性粒细胞髓过氧化物酶产生的次氯酸(HClO)作用于蛋白质而形成的,主要存在于白蛋白中,其结构中存在双酪氨酸和活性羰基基团,光谱分析显示在酸性条件下波长340nm处有明显的光吸收峰,与天然蛋白质光吸收峰处于280nm的光谱特性不同,提示在次氯酸氧化作用下天然蛋白质已发生了分子结构和生化特性的改变。近来的研究表明AOPPs的慢性蓄积可促进糖尿病肾以及非糖尿病肾的炎症状态,并可加重高脂血症动物模型动脉的炎症和氧化应激,这些数据表明AOPPs可能参与组织的炎症进展。此外,在体外的研究表明AOPPs诱导多种细胞如血管内皮细胞,肾小管上皮细胞,肾小球系膜细胞等的功能障碍,证明AOPPs是干扰细胞正常功能的一个病理因素,那么,AOPPs可否影响脂肪细胞的脂质分解功能尚不清楚。脂组织中储存的甘油三酯(TG)分解为脂肪酸(FA)需要甘油三酯脂肪酶(ATGL),激素敏感脂肪酶(HSL)等的协同作用有序的进行,ATGL和HSL是脂质分解的关键酶,共占据了鼠白色脂肪组织脂质分解酶的95%以上.HSL主要参与激素刺激的脂解过程,激素刺激脂解作用最重要的活性剂是儿茶酚胺,它可通过β肾上腺受体激活腺苷酸环化酶增加细胞内的cAMP水平,cAMP可活化PKA,PKA磷酸化HSL和脂滴包被蛋白perilipinA,HSL从细胞浆移位至脂滴表面,与脂滴表面的PeriA结合发挥水解酶活性,HSL的磷酸化位点563,659,660是PKA介导的脂解的靶目标.ATGL敲除鼠甘油三酯(TG)在多组织中沉积证实ATGL是甘油三酯水解第一步的关键酶,ATGL不仅调节基础状态下的脂解过程也参与激素刺激状态的脂解过程,在PKA刺激下,perilipin的磷酸化使CGI-58与perilipin脱离并转而与ATGL结合,在CGI-58的辅助活化作用下,ATGL的活性可增加20倍.多条信号通路调节脂解作用.Gs/AC/PKA/HSL通路是了解的最透彻的一条,许多激素和肽可与Gs蛋白配对的p受体结合活化腺苷酸环化酶增加细胞内的cAMP水平,儿茶酚胺类是活化这一通路的典型代表,近来的研究表明儿茶酚胺不仅能活化PKA,也能活化有丝分裂原蛋白激酶通路(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)来调节脂解作用.证实了脂解的调节除了经典的cAMP途径外还有ERK1/2通路的调节.体外研究表明ERK可磷酸化HSL的Ser600,增加HSL的活性。体内实验中我们以5/6肾切除慢性肾衰大鼠作为模型,观察是否存在脂质分解增加及相应脂肪酶的表达及活性的变化,并探讨调节脂肪分解酶的信号通路活性的变化。目的在于探讨慢性肾衰脂肪消耗发生发展的可能机制。体外实验中我们探讨AOPPs对3T3-L1脂肪细胞脂质分解的影响,同时观察其相应脂肪分解酶的变化；即探讨AOPPs对脂肪细胞脂质分解的影响及机制。实验选择体外培养的具有代表性的3T3-L1小鼠前脂肪细胞系作为脂肪细胞模型,观察氧化修饰的小鼠白蛋白(AOPP)对3T3-L1小鼠前脂肪细胞脂质分解的影响。研究方法第一部分：体内试验一、二步法5/6肾切除建立慢性肾衰模型的制备1)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位固定于鼠台上。2)酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。3)依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾（此处忽略..）的2/3,明胶海绵压紧上、下极创面止血,放松血管夹,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。缝合前,腹腔内滴注青霉素注射液,预防感染。假手术组只作肾包膜剥离术。4)一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm处行纵行切口(切口略高于左侧),分离肌层,游离肾脏,无损伤血管夹夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只作肾包膜剥离术。5)在整个手术完成后的第四,九,十六周大鼠眼眶后静脉采血测定血清肌酐,血尿素氮。二、脂肪块的提取及甘油的测定1)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上2)腹主动脉采血后采用放血法处死大鼠3)酒精消毒皮肤,分离附睾及腹膜后脂肪垫(内脏脂肪)及腹股沟处(皮下脂肪)脂肪垫,迅速移至盛有1xPBS(PH7.4)的培养皿中,称重4)PBS反复清洗脂肪垫,剔除肉眼可见血管,将脂肪垫剪成大小约1-3mm2大小的脂肪块,在10ml含2%无脂肪酸BSA的KRB磷酸盐缓冲液中孵育5h,收集孵育液,3000xg离心5min,测定甘油含量,以脂肪块重量校正。三、天花板方法培养原代脂肪细胞及油红染色鉴定1)收集新鲜脂肪垫组织,迅速放入盛有1xPBS缓冲液中(PH7.4),称重,剪碎(2-3mm),用Ⅰ型胶原酶溶液(0.75mg/ml)消化脂肪组织,37℃,220rpm水浴摇床消化一小时2)消化好的脂肪组织通过250-μm的滤网过滤,400xg离心5min,单房脂肪细胞漂浮在上层,沉积物则是成纤维细胞,红细胞和前脂肪细胞等。用长钊抽吸掉下层细胞,加入PBS清洗脂肪细胞,400xg离心5min,用长针抽吸掉下层细胞,重复三次.3)吸取漂浮在上层的脂肪细胞,接种到25cm2的培养瓶中,接种密度大约为1×104-5×104,培养瓶须完全的充满培养基,培养基为含10%FBS的高糖DEME培养基,翻转培养瓶,脂肪细胞漂浮并贴附在天花板面,在37℃,5%C02孵箱中培养4)在七天过后,翻正培养瓶,这样脂肪细胞就贴在底面,显微镜观察发现脂肪细胞已贴壁,并且无混杂的其他细胞污染,因为通过反复的离心以及抽吸已经清除了混杂细胞,用油红染色鉴定脂肪细胞四、提取原代的脂肪细胞测定基础及激素刺激状态下的甘油释放量1)收集新鲜的皮下(腹股沟)及内脏(附睾及腹膜后)脂肪垫组织,迅速放入盛有1xPBS缓冲液中(PH7.4),称重,剪碎(2-3mm),用Ⅰ型胶原酶溶液(0.75mg/ml)消化脂肪组织,37℃,220rpm摇床消化一小时2)消化好的脂肪组织通过250-μm的滤网过滤,400xg离心5min,脂肪细胞漂浮在表面,间质-内皮细胞则沉积在离心管底,用长针抽吸掉下层细胞,加入含200nM腺苷含2%无脂肪酸BSA的KRB缓冲盐液清洗脂肪细胞,400xg离心5min,长针抽吸掉下层细胞,重复三次.3)吸取500ul漂浮于上层的压积的脂肪细胞混悬液于1.5ml细胞孵育液(含2%无脂肪酸BSA的KRB缓冲液)中孵育5h,孵育之后提取上清,3000xg离心5min,测定基础状态下的甘油含量,以脂肪细胞蛋白总量校正；评估激素动员情况下原代脂肪细胞脂质分解的影响,加入10μmol/L的异丙肾上腺素与脂肪细胞孵育5h,收集上清,测定甘油含量,以脂肪细胞蛋白总量校正。五、原代前脂肪细胞的培养和诱导分化1)收集新鲜内脏(附睾及腹膜后)及皮下(腹股沟)脂肪垫组织,迅速放入盛有1xPBS缓冲液中(PH7.4),称重,剪碎(2-3mm),用Ⅰ型胶原酶溶液(0.75mg/ml)消化脂肪组织,37℃,220rpm摇床消化一小时2)消化好的脂肪组织通过250-μm的滤网过滤,1000xg离心3min,DMEM培养基洗涤细胞,1000xg离心3min,重复三次,用10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重新混悬细胞块,移入25cm2的培养瓶中,在37℃、5%CO2条件下培养,待细胞生长至完全融合2d后开始诱导分化(诱导分化第0天),即加含0.5mmol/L3-异丁基1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、0.25μmol/L地塞米松(DEX)和10μg/ml胰岛素(Insulin)的10%胎牛血清的高糖DMEM培养48h后,换只含10μg/ml胰岛素的培养液再培养48h,随后以10%胎牛血清高糖DMEM的完全培养基继续培养,每2d换培养液1次,在诱导分化的第3-4天即可见脂滴出现,诱导分化后的第8-12天分化成熟。六、原代前脂肪细胞分化成熟鉴定应用油红O染色鉴定分化成熟的原代前脂肪细胞。先用1×PBS洗细胞3次,3.7%多聚甲醛固定细胞15-20min,PBS洗净后尽量吸干液体,加入0.5%油红O染液(0.5g油红粉末溶于60%的异丙醇100ml,过滤使用)于细胞表面,室温作用1小时,后用PBS洗细胞以去除多余的染料。倒置显微镜下观察结果,拍摄照片,鉴定脂肪细胞分化成熟。实验各组脂肪细胞经油红O染色后,加异丙醇溶解油红O,用分光光度计测定各瓶在490nm的OD值,以此反映胞内甘油三酯含量的高低。用细胞蛋白总量校正。七、HSL,HSLser-563,HSLser-660,ATGL,CGI-58,P-PKA,PKA,P-ERK,ERK,P-JNK,JNK,P-P38,P38蛋白表达的测定处死大鼠,迅速提取大鼠腹膜后脂肪和附睾脂肪(内脏脂肪)以及腹股沟脂肪(皮下脂肪),PBS清洗脂肪垫,去除可见血管,称重,彻底剪碎脂肪组织,按组织重量：裂解液=1：4的比例用匀浆器反复上下匀浆脂肪组织,以上操作均在冰上进行,匀浆完全后,13000xg,4℃离心40min,去掉漂浮于上层（此处忽略..）的脂滴块,提取下层匀浆,即为脂肪组织总蛋白,加入5x上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,WesternBlotting检测HSL磷酸化位点563,660及HSL,ATGL,CGI-58,信号通路P-PKA/PKA,P-ERK/ERK,P-JNK/JNK,P-P38/P38蛋白的表达水平.八、ATGL与CGI-58的结合用免疫沉淀法检测.ATGL与CGI-58的结合。每组取110μg组织蛋白,用裂解液调整浓度为1μg/μl,加入390μlPBS,调成500μl的总体积,每管样品中加入10μl的抗-CGI-58抗体及10μl的琼脂糖A/G珠,4℃摇床摇6-10h。12,000xg离心5min,洗涤,12,000xg离心5min,重复三次,弃去上清。样本蛋白与2×SDS样品缓冲液混匀,100℃水浴煮沸5分钟变性。Westernblotting法检测ATGL与CGI-58的结合。九、统计方法所有数据均代表3次重复实验的结果,以均数±标准差表示。所有统计由统计软件SPSS13.0完成。两个样本均数的比较采用Independent-SamplesTTest,P0.05为差异有统计学意义。第二部分：体外实验一、AOPP的制备将20mg/ml小鼠白蛋白与40mmol/l次氯酸等体积混合,室温放置30分钟,其摩尔比为1：140(MSA：次氯酸)。制备的AOPP在无内毒素PBS中透析24小时,除去游离的次氯酸。用0.22gm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20mg/mlMSA与PBS等体积混合,作为对照。AOPP含量通过测定酸性条件下340nm的吸光度,以氯胺T为标准取得。通过鲎试验法检测,该方法制备的AOPP内毒素含量均低于0.25EU/ml。二、3T3-L1前脂肪细胞的培养和诱导分化3T3-L1前脂肪细胞采用美国ATCC细胞株.复苏后在37度,5%C02,10%FBS的高糖DMEM培养基中培养,传代。细胞状态良好时接种于培养板,待细胞生长至融合2d后,加含0.5mmol/L异丁基-3-甲基黄嘌呤、0.25μmol/L地塞米松、10μg/ml胰岛素和10%FBS的含糖DMEM(4.5mg/L)培养48h,换以含10μg/ml胰岛素10%FBS培养液再培养48h,随后以含10%FBS的含糖DMEM(4.5mg/L)培养液继续培养,每隔48h换1次培养液,诱导分化8-10d的3T3-L1细胞95%以上呈脂肪细胞表型.实验前改换用不含FBS的DMEM中继续培养过夜,使细胞处于同步生长状况,然后用于实验。三、细胞上清中甘油浓度的测定3T3-L1前脂肪细胞分化成熟,用无血清培养基静置12-24小时后,PBS轻轻洗涤细胞两次,加入2ml不含酚红的DMEM培养基,与0、50、100、200μg/mlAOPP或200μg/ml未经修饰的MSA共同孵育,于0、6、12及24小时收集细胞上清。在阻断实验中,细胞分别与PKA抑制剂H89(20μM)、ERK抑制剂PD9805(75μM)、JNK抑制剂SP600125(20μM)及P38抑制剂SB203580(20μM)预孵育2小时,用200μg/mlAOPP刺激24小时。收集细胞上清并进行细胞裂解。用GPO-TrinderReagent法检测甘油在细胞上清中的浓度,以细胞蛋白量矫正。四、AOPP刺激脂肪细胞后脂肪酶HSL,ATGL及ATGL辅助活化因子CGI-58蛋白水平的表达检测脂肪细胞分别与50、100、200μg/mIAOPP或200μg/ml未经修饰的MSA共同孵育0、6、12及24小时,收集细胞总蛋白,WesternBlotting检测脂肪酶HSL,ATGL及ATGL辅助活化因子CGI-58蛋白水平的表达检测。五、AOPP对激素敏感脂肪酶HSL的活化脂肪细胞分别与50、100、200μg/mlAOPP或200μg/ml未经修饰的MSA共同孵育0、1、3、6、12及24小时,收集细胞总蛋白,WesternBlotting检测脂肪酶HSL磷酸化位点563,660及总的HSL蛋白水平的表达检测。六、AOPP对蛋白激酶A(PKA)的活化脂肪细胞与200μg/mlAOPP或200μg/ml未经修饰的MSA共同孵育0、1、3、6、12及24小时,收集细胞总蛋白,WesternBlotting检测蛋白激酶A(PKA)磷酸化及总的PKA蛋白水平的表达检测。七、AOPP对ERK,JNK,P38的活化脂肪细胞与200μg/mlAOPP或200μg/ml未经修饰的MSA共同孵育0、1、3、6、12小时,收集细胞总蛋白,WesternBlotting检测ERK磷酸化及总的ERK蛋白水平表达检测,JNK磷酸化及总的JNK蛋白水平的表达检测,P38磷酸化及总的P38蛋白水平的表达检测。八、统计方法所有数据均代表3次重复实验的结果,以X±S表示。所有统计由统计软件SPSS13.0完成。多个样本均数的比较采用One-WayANOVA,两两比较采用LSD和SNK,P0.05为差异有统计学意义。结果第一部分：体内试验一、肾衰大鼠模型的确立在二步法5/6肾切除手术建立大鼠肾衰模型后的第四,九,十六周采集大鼠血液测定大鼠肌酐,尿素氮水平,发现在第四周肾衰组的大鼠肌酐水平既有显著增高(P0.05)。第九周CRF组血甘油三酯水平(P0.05),BUN也显著增加(P0.05),第十六周测定血甘油水平CRF组有显著增高(P0.05)。在十六周时CRF组的体重比假手术组减轻(P0.05)。二、大鼠皮下及内脏脂肪块脂质分解的测定实验分组为假手术组,CRF组；在第十七-十八周分批处死大鼠,收集大鼠腹股沟(皮下脂肪)及附睾,腹膜后处脂肪垫(内脏脂肪),清洗脂肪块,剔除可见血管,将脂肪垫剪切成大小约1-3mm2的脂肪小块,用含2%无脂肪酸BSA的KRB缓冲盐溶液孵育（文章此处忽略..）脂肪小块约数小时,收集上清及脂肪小块,测定甘油含量,以脂肪小块总质量校正甘油释放量,发现皮下及内脏脂肪CRF组的甘油含量比假手术组有显著增高(P0.05)。三、天花板方法培养原代脂肪细胞及油红染色收集新鲜脂肪垫组织,迅速放入盛有1xPBS缓冲液中(PH7.4),称重,剪碎(2-3mm),用Ⅰ型胶原酶溶液(0.75mg/ml)消化脂肪组织,37℃,220rpm摇床消化一小时；消化好的脂肪组织通过250-μm的滤网过滤,400xg离心5min,单房脂肪细胞漂浮在上层,吸取漂浮在上层的脂肪细胞,接种到25cm2的培养瓶中,接种密度大约为1×104-5×104,培养瓶须完全的充满培养基,并赶走气泡；培养基为含10%FBS的高糖DEME培养基,翻转培养瓶,脂肪细胞漂浮并贴附在天花板面,在37℃,5%C02孵箱中培养；在七天过后,翻正培养瓶,这样脂肪细胞就贴在底面,用油红染色鉴定脂肪细胞；证明我们分离出的是成熟的脂肪细胞,并且没有其他混杂细胞的污染。四、提取原代的脂肪细胞测定基础及激素刺激状态下的甘油释放量处死大鼠,迅速收集大鼠腹股沟(皮下脂肪)及附睾,腹膜后处脂肪垫(内脏脂肪),消化分离获得成熟脂肪细胞,在含2%无脂肪酸BSA的KRB缓冲盐溶液中孵育数小时,收集上清测定甘油含量,以脂肪细胞总蛋白量校正,发现基础状态下皮下及内脏脂肪CRF组与假手术组相比脂解率显著增高(p0.05),在异丙肾上腺素动员情况下的测得的甘油含量,皮下及内脏脂肪CRF组脂解率均比假手术组显著增高(p0.05)五、原代前脂肪细胞分化成熟签定应用油红O染色鉴定分化成熟的原代前脂肪细胞,实验各组脂肪细胞经油红O染色后,加异丙醇溶解油红O,用分光光度计测定各瓶在490nm的OD值,以此反映胞内甘油三酯含量的高低。用细胞蛋白总量校正。皮下及内脏假手术组,CRF组的油红染色结果表明各组的分化率并无不同(P0.05).七、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪HSL的活化情况及总蛋白的表达变化(1)内脏脂肪组：CRF组HSL的磷酸化位点563,660与假手术组相比活化增加(P0.05),两组的总蛋白表达无显著差异(p0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组HSL的磷酸化位点563,660与假手术组相比活化增加(P0.05),CRF组总蛋白HSL的表达与假手术组相比有显著增高(p0.05)八、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表达变化(1)内脏脂肪组：CRF组的ATGL蛋白表达与假手术组相比无显著差异(P0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的ATGL蛋白表达与假手术组相比显著增加(p0.05)九、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪CGI-58的表达变化(1)内脏脂肪组：CRF组的CGI-58蛋白表达与假手术组相比显著增加(p0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的CGI-58蛋白表达与假手术组相比显著增加(p0.05)十、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪ATGL与CGI-58的结合(1)内脏脂肪组：CRF组的ATGL与CGI-58结合与假手术组相比显著增加(p0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的ATGL与CGI-58结合与假手术组相比显著增加(p0.05)十一、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪PKA的活化情况(1)内脏脂肪组：CRF组的P-PKA与假手术组相比显著活化(p0.05),两组的总蛋白表达无差异(P0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的P-PKA与假手术组相比显著活化(p0.05),两组的总蛋白表达无差异(P0.05)十二、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪ERK的活化情况(1)内脏脂肪组：CRF组的P-ERK与假手术组相比显著活化(p0.05),总蛋白表达无变化(p0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的P-ERK与假手术组相比显著活化(p0.05),总蛋白表达无变化(p0.05)十三、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪JNK的活化情况(1)内脏脂肪组：CRF组的P-JNK与假手术组相比显著活化(p0.05),总蛋白表达无变化(p0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的P-JNK与假手术组相比显著活化(p0.05),总蛋白表达无变化(p0.05)十四、慢性肾衰大鼠皮下及内脏脂肪P38的活化情况(1)内脏脂肪组：CRF组的P-P38与假手术组相比显著活化(p0.05),总蛋白表达无变化(p0.05)(2)皮下脂肪组：CRF组的P-P38与假手术组相比显著活化(p0.05),总蛋白表达无变化(p0.05)结论：1.慢性肾衰存在脂质分解增加2.内脏脂肪脂质分解酶HSL和ATGL的活性增加,皮下脂肪脂质分解酶HSL和ATGL的活性增加,表达也增多3.与酶活化相关的PKA,MAPKs活化第二部分：体外实验一、AOPP的鉴定制备的次氯酸修饰的小鼠血清白蛋白和未经修饰的小鼠血清白蛋白的蛋白浓度分别为9.5mg/ml和10.3mg/ml,AOPP含量分别为700μmol/l和1.56μmol/l,经蛋白浓度矫正后分别为73.7nmol/mg蛋白和0.15nmol/mg蛋白。所有制备的AOPP或未经修饰的MSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。二、AOPP对脂肪细胞分泌目甘油的影响AOPP200μg/ml与脂肪细胞共同孵育0、6、12和24小时后,经细胞蛋白总量校正后上清中甘油含量随刺激时间的延长而上调,呈时间依赖性。同时,不同剂量AOPP(50,100,200ug/ml)孵育细胞24小时,随着AOPP剂量的增加,经细胞蛋白总量校正后上清中甘油浓度逐渐增高,并呈浓度依赖性。未被修饰的小鼠血清白蛋白对脂肪细胞甘油释放量无明显影响(P0.05)。三、AOPP对脂肪酶HSL,ATGL及ATGL辅助活化因子CGI-58蛋白水平的影响脂肪细胞分别与50、100、200μg/mlAOPP或200μg/ml未经修饰的（此处忽略..）MSA共同孵育0、6、12及24小时,收集细胞总蛋白,WesternBlotting检测脂肪酶HSL,ATGL及CGI-58蛋白水平的表达,三者蛋白水平均无显著差异(P0.05)。四、AOPP对激素敏感脂肪酶HSL磷酸化的影响AOPP200μg/ml与脂肪细胞共同孵育0,1h,3h,6h,12h,24h后,能引起激素敏感脂肪酶HSL丝氨酸位点563,660磷酸化,并在12h时最明显(P0.05),未被修饰的小鼠血清白蛋白对HSL磷酸化活性无明显影响(P0.05)。不同剂量AOPP(50,100,200ug/ml)孵育细胞24小时,随着AOPP剂量的增加,HSL磷酸化活性增加,呈浓度依赖性(P0.05),未经修饰的小鼠血清白蛋白对HSL磷酸化活性无明显影响(P0.05)。24h内HSL总蛋白表达没有明显改变(P0.05).五、AOPP对蛋白激酶A(PKA)磷酸化的影响AOPP200μg/ml与脂肪细胞共同孵育0,1h,3h,6h,12h后,能引起蛋白激酶A(PKA)磷酸化,并在1h时最明显(P0.05),未被修饰的小鼠血清白蛋白对PKA磷酸化活性无明显影响(P0.05)。12h内PKA总蛋白表达没有明显改变(P0.05).六、AOPP对MAPKs家族磷酸化的影响(1)AOPP对ERK磷酸化的影响AOPP200μg/ml与脂肪细胞共同孵育0,1h,3h,6h,12h后,能引起ERK磷酸化,并在12h时最明显(P0.05),未被修饰的小鼠血清白蛋白对ERK磷酸化活

以上为本篇毕业论文范文慢性肾衰增加脂肪组织脂质分解的介绍部分。

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