X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究

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X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究

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毕业论文范文题目：X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究，论文范文关键词：X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究
X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linkedadrenoleukodystrophy,X-ALD)是最常见的过氧化物酶体病,主要侵犯肾上腺和脑白质等器官,根据临床表现Hugo等将其分为9型:MRI正常的无症状型、MRI异常的无症状型、MRI正常的单纯Addison病型、MRI异常的单纯Addison病型、轻度大脑型、重度大脑型、单纯肾上腺脊髓神经病型、大脑型合并肾上腺脊髓神经病型、小脑型,其中大脑型占47~48%。X-ALD是由ABCD1基因突变所致,该疾病基因定位于染色体Xq28,其成熟mRNA长约3.7kb,编码一个含745个氨基酸残基的蛋白质,称为ABCD1蛋白。X-ALD的发病机制是由于体内的极长链饱和脂肪酸(saturatedverylongchainfattyacid,VLCFA)不能进入过氧化物酶体进行β-氧化,从而过度蓄积,导致脑白质脱髓鞘改变及肾上腺皮质功能减退。患者一旦发病,往往产生不可逆的神经系统症状。应用分子诊断方法,对X-ALD患者及其家系成员的ABCD1基因进行分析,确定患者的ABCD（此处忽略..）1基因突变位点和类型以及家系其他成员的基因型,不仅可为ALD患者提供明确的诊断,而且可为遗传咨询、产前诊断提供依据。本研究分别从cDNA和基因组DNA两条途径为6个X-ALD家系进行分子诊断。采用长链RT-PCR技术,从患者外周血提取总RNA并合成cDNA,以cDNA为模板,扩增ABCD1基因编码区全长,再分4个片段进行二次PCR,并对PCR产物直接测序;应用DHPLC、DNA测序等方法分析患者的基因组DNA,进一步确证其ABCD1基因突变。结果显示:6个X-ALD家系患者的ABCD1基因上均存在突变,其中患者1的ABCD1基因第177位密码子发生了CAG→TAG突变,使原来编码的谷氨酰胺被终止密码子取代(Q177X);患者2的ABCD1基因第401位密码子发生了CGG→CAG突变,使原来编码的精氨酸被谷氨酰胺取代(R401Q);患者3的ABCD1基因第276位密码子发生了AAG→GAG突变,使原来编码的赖氨酸被谷氨酸取代(K276E);患者4的ABCD1基因第174位密码子发生了TAC→TGC突变,使原来编码的酪氨酸被半胱氨酸取代(Y174C);患者5的ABCD1基因第（略..）602位密码子发生了AAG→TAG突变,使原来编码的赖氨酸被终止密码子取代(K602X);患者6的ABCD1基因第314位密码子发生了GCC→CCC突变,使原来编码的丙氨酸被脯氨酸取代(A314P)。经查阅国内外文献及www.X-ald.nl数据库,其中K602X和A314P突变尚未见报道。在证实先证者的ABCD1基因突变后,本研究对4个X-ALD高风险胎儿进行产前分子诊断。在妇产科医师的配合下,抽取羊水,提取羊水细胞基因组DNA,采用亲子鉴定试验评估母体基因组DNA污染,用PCR-RFLP、DNA序列测定和DHPLC对胎儿羊水基因组DNA的ABCD1基因进行分析。结果显示:在家系1中,用BcnI切割799bp的PCR产物,胎儿1与其父亲酶切模式一致,PCR产物测序未发现胎儿1的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(P560L突变)。在家系2中,DHPLC分析232bp的PCR产物,胎儿2与其父亲洗脱峰的峰型相似,而与先证者的峰型不同,PCR产物测序未发现胎儿2的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(Q177X突变)。在家系3中,用AciI切割271bp的PCR产物,胎儿3与先证者酶切（文章此处忽略..）模式一致,PCR产物测序发现胎儿3的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(R617C突变)。在家系4中,DHPLC分析269bp的PCR产物,胎儿4与其父亲洗脱峰的峰型相似,而与先证者的峰型不同,PCR产物测序未发现胎儿4的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(K276E突变)。亲子鉴定试验还显示,胎儿1、2为女性,胎儿3、4为男性;由此推断,胎儿1、2为正常纯合子,胎儿3为ALD半合子,胎儿4为正常半合子。本研究利用分子克隆技术,从正常人及X-ALD患者(分别带K276E突变和P560L突变)的外周血中提取总RNA,反转录成cDNA。以cDNA为模板,自行设计引物,进行ABCD1基因编码区全长的PCR扩增,应用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ消化PCR产物后,与增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N2连接。将连接产物转化JM109菌株,挑选重组菌,并从中抽提重组质粒。用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切割重组质粒,并对重组质粒插入片段进行序列测定。结果显示,XhoⅠ和EcoRⅠ酶可以从重组质粒切下大小为2253bp片段,与预期相符;一个重组质粒的插入片段与野生型ABCD1基（文章此处忽略..）因序列相一致,一个重组质粒插入片段带K276E突变,另一个重组质粒插入片段带P560L突变。将3个重组质粒分别命名为pEGFP-N2-ABCD1、pEGFP-N2-ABCD1(K276E)、pEGFP-N2-ABCD1(P560L)。通过本研究,建立了X-ALD的分子诊断方法,并在中国人X-ALD患者中发现2个新的ABCD1基因突变,即K602X和A314P突变。提出了一个新的ALD产前分子诊断方案,确保了产前诊断的准确性。成功建构了野生型ABCD1基因及2个突变型ABCD1基因的真核表达载体,为将来研究X-ALD的分子发病机理奠定了基础。

以上为本篇毕业论文范文X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究的介绍部分。

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