猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆

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猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆

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毕业论文范文题目：猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆，论文范文关键词：猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆
猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标：囊虫病是由囊尾蚴引起的人兽共患病，是一种世界上分布较广的寄生虫病。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等重要器官寄生，其中以寄生于神经体系的脑囊虫病引起的临床症状最为重大，极大迫害了人类健康。然而目前临床上对该病的诊断仍以CT或磁共振（MR）作为最重要的客观指标。但鉴于CT或MR昂扬费用，因此单凭CT或MR作为标准进行疗效评估及大范围的风行病学普查是很不事实的。研制简便、疾速、正确的诊断方法及诊断试剂已成为当前国内外医学专家攻克该病的工作的重点。跟着基因工程技巧手段始终完美，分别出特异性高、敏感性好的蛋白抗原已成为可能。本研究采取基因重组技巧，以开发囊虫病特异性诊断用融合抗原跟防备用疫苗为目标，从已构建的猪囊尾蚴cDNA文库中拟筛选出囊尾蚴特异性抗原基因，从而为进一步研究其蛋白质功能、构造奠定基本。方法：1、病人血清的预处理：将经CT或磁共振（MR）（略..）确诊的脑囊虫病人血清按1：10比例稀释于TBS缓冲液中，稀释后血清与液氮反复冻融后的XL1-Blue-MRF'菌裂解液充分混淆，室温放置4小时，500g离心10min，取上清播种吸附后抗血清。2、cDNA文库免疫学筛选：用此血清作为一抗，以辣根过氧化酶标记的羊抗人抗体作为二抗，筛选已构建的猪囊尾蚴cDNA文库，获得含阳性cDNA的噬菌体，经液体培养后提取噬菌体DNA。3、阳性cDNA片WP=4段的PCR扩增：以筛选出的噬菌体DNA为模板，利用cDNA插入片段两端的通用引物T3跟T7进行PCR扩增，扩增前提为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延长1min,30个轮回结束72℃延长10min。4、cDNA片段的亚克隆：PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化后，经EcoRI及KpnI末端润饰与含相应粘性末端的PUC18质粒载体进行体外定向重组，连接产物转化感触态E.coliJM109，（此处忽略..）在含氨苄青霉素、IPTG以及x-gal的LB培养基培养，根据β-半乳糖甘酶的α互补准则筛选重组子筛选白色菌落，按碱裂解法提取质粒掉队行双酶切，鉴定是否含有插入片段，5、序列测定及同源性比较：用Sanger双脱氧末端终止法测定插入片段的核苷酸序列，用GENETYX软件分析推导核苷酸序列编码的氨基酸序列，并在NCBI中经过BLASTN及BLASTP进行核苷酸及氨基酸序列同源性检索，寻找同源片段。6、进行Northern杂交分析断定该阳性片段mRNA大小：利用异硫氰酸胍一步法提取猪囊尾蚴总RNA，经琼脂糖凝胶电泳跟紫外分光光度法测定其完全性、纯度以及含量；走RNA变性电泳（甲醛变性凝胶电泳）分别RNA，以20xSSC作为转移液经毛细管虹吸作用将变性凝胶中RNA转移至尼龙膜上，80℃干烤2小时固定RNA，以筛选出的阳性cDNA片段为模板按照随机引物标记法对其进行（略..）同位素标记制备杂交用探针，与尼龙膜上已经过预杂交的RNA进行杂交反应，洗膜掉队行喷射自显影，断定杂交信号大小。成果：从cDNA文库中筛选出长度为553bp的cDNA片段（命名为cYI），Northern杂交成果也显示在0.6kb处WP=5有一杂交带。该基因片段含有一个开放读码框，位于2-484bp处，编码160个氨基酸，分子量为18.34kDa。序列5'端未发明起始密码子，末端有TAA组成的终止密码子位于第481bp处；3'端有poly（A）信号及poly（A）尾巴；其核苷酸序列中（A+T）%=56%，（G+C）%=44%；该片段含有限度性内切酶位点：第38位含有PstI、83位中含有SphI、74、283位中含有RsaI限度性内切酶酶切位点。其氨基酸序列中疏水性残基占33.75%(54/160)、亲水性残基占46.88%(75/160)、中性残基占19.38%(31/160)。经过NCBI中的BLASTN及BLASTP同源序列分析表明cYI片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因（命名（此处忽略..）为NC-9）同源性较高，对cYI基因与NC-9基因进行核苷酸序列及氨基酸序列比较发明：cYI基因序列从第8位开端包含了全部NC-9基因，其中仅有8个位点的碱基产生了改变，同源性高达98%；cYI编码的160个氨基酸残基，从第30位的氨基酸开端直到编码序列结束，共有130个氨基酸残基，仅有3个位点的氨基酸残基不同，同源性高达97%。同源序列分析中未发明大片段高同源性的其余物种的基因片段。论断：本实验从猪囊尾蚴cDNA文库筛选出一长553bp的基因，此基因片段编码的蛋白质能与病人血清产生特异性反应。

以上为本篇毕业论文范文猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆的介绍部分。

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