肝螺杆菌甲基基团接收趋化信号转导蛋白的克隆表白纯化及血清学利

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肝螺杆菌甲基基团接收趋化信号转导蛋白的克隆表白纯化及血清学利

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毕业论文范文题目：肝螺杆菌甲基基团接收趋化信号转导蛋白的克隆表白纯化及血清学利，论文范文关键词：肝螺杆菌甲基基团接收趋化信号转导蛋白的克隆表白纯化及血清学利
肝螺杆菌甲基基团接收趋化信号转导蛋白的克隆表白纯化及血清学利毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标跟意思克隆肝螺杆菌(Helicobacterhepaticus,Hh)甲基基团接收趋化信号转导蛋白(methyl-acceptingchemotaxissignaltransductionprotein,MCP)基因,制备MCP重组蛋白作为抗原,从而制备ELISA检测试剂盒检测Hh感染者血清中的特异性免疫球蛋白,为检测我国人群肝螺杆菌感染率及探讨人类肝脏疾病跟肠道非特异性炎症的病因提供实验基本。材料跟方法1、重要材料:肝螺杆菌菌株,原核表白质粒pET22b(+),抗His单克隆抗体,空肠曲折菌抉择性血琼脂培养基,镍亲跟层析柱,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG,辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG。2、方法2.1引物设计根据GenBank选取肝螺杆菌基因HH1088中的一段长为255bp的保守区基因片段(即MCP),利用PrimerPremier5.0设计引物,上游(C255F)5'GACGAATTCCGTAGAGCAAGGGGATTTC3'(含EcoRI酶切位点),下游(C255R)5'CGCCTCGAGTCTTTGTTTGAGCATTTT3'(含XhoI酶切位点),以肝螺杆菌全基因组为模板,进行PCR扩增。2.2MCP基因原核表白质粒的构建肝螺杆菌保种菌液(由本实验室保存)取100μl涂布于空肠曲折菌抉择性血琼脂培养基(含7%冻融脱纤维羊血,抉择性抗生素万古霉素10mg/L,多粘菌素B2500单位/L,二性霉素B10mg/L,TMP5mg/L),37℃微需氧前提(5%O_2,10%CO_2及85%N_2)下培养,每天察看有无菌落成长。将透明、针尖大小的菌落用棉签刮至EP管中,PBS冲刷三次后,用细菌基因组DNA提取试剂盒提肝螺杆菌DNA。以肝螺杆菌全基因组DNA为模板,用Hotstart酶进行PCR扩增,反应前提为94℃30min总变性,94℃30s,50℃30s,72℃45s,共35个轮回,72℃10min总延长。所得目标片段回收后在限度性内切酶EcoRI跟XhoI作用下37℃水浴1小时进行酶切反应,插入至原核表白载体pET22b(+)的EcoRI跟XhoI之间,所得质粒命名为pET22b+/MCP,经酶切及PCR鉴定掉队行测序。2.3MCP基因在大肠杆菌中的表白将重组质粒pET22b+/MCP转化大肠杆菌感触态BL21(DE3),挑单克隆接种于10ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基,37℃200rpm培养3个半小时至OD_(600)约为0.6-1.0。转接100μl于10ml含氨苄青霉素100μg/ml的（本文此处忽略..）LB培养基中,37℃200rpm培养1个半小时至OD_(600)约为0.6,参加500mmol/LIPTG至终浓度为1mmol/L,37℃180rpm培养4个小时。将引诱菌液12000rpm4℃离心5min,取1ml菌液积淀进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白rhMCP包含表白载体pET22b(+)中的6×His标签,因此用Westernblot对rhMCP的表白再次进行鉴定。2.4rhMCP蛋白的纯化取1000ml引诱表白的菌液,12000rpm4℃离心5min,菌体积淀参加1/20细菌成长体积的细菌裂解液跟PMSF,冰上超声粉碎细菌,10000rpm4℃离心15min。弃上清,往积淀中参加1/20细菌成长体积的UrNTA-0Buffer跟PMSF,将细胞悬浮,室温放置30min,10000rpm4℃离心15min,取上清。用30ml的UrNTA-0Buffer均衡3mlNTA层析柱,上清液上柱,收集穿透部分,用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。15mlUrNTA-0Buffer洗脱未结合部分,而后分辨用15mlUrNTA-20,UrNTA-40,UrNTA-60,UrNTA-100,UrNTA-200,UrNTA-500洗脱,收集洗脱液,用SDS-PAGE断定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。用梯度PBS-尿素4℃透析(6M-4M-2M-1M),每4小时换液一次,最后用PBS4℃透析24小时。BCA法测蛋白浓度,-70℃保存。2.5小鼠H.hepaticus感染血清学分析购买裸鼠21只,其中出生2-3天的乳鼠9只;NIH孕鼠2只,其后解剖NIH悉生鼠24只,NIH个别小鼠6只(均购于南方医科大学动物核心),一方面取结肠组织提取基因组DNA后,以C255F/C255R特异性引物进行PCR扩增,所得PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,阳性者进一步测序鉴定;另一方面经心脏或颈动脉取血,血液置于EP管中室温静置2小时,2000rpm离心15min后取血清,-80℃保存。在棋盘滴定法断定最佳包被浓度跟样品最佳稀释度后,以纯化的蛋白rhMCP5μg/ml包被酶标板,每孔200μl,设复孔,4℃过夜;次日次序参加1∶100稀释的小鼠血清、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶10000稀释)、最后参加底物OPD显色,终止反应后用酶标仪进行双波长测定OD_(492)(OPD敏感波长)跟OD_(630)(非敏感波长,可打消孔底指痕、污物的影响)。终极的样品OD值为样品OD值(OD_(492)-OD_(630))与空白孔(只加底物跟终止液)的差值。2.6人类H.hepaticus感染的ELISA血清学检测临界值断定选取2008年（略..）12月至2009年3月期间在我院消化科确诊的住院病人,共收集50例患者粪便标本跟血清标本作为病例组,其中肝脏疾病10例(包含肝炎后肝硬化8例,肝癌2例),结肠癌10例,肠道溃疡性病变10例(包含克罗恩病4例,溃疡性结肠炎6例),十二指肠溃疡9例,胃部疾病11例(包含单纯性胃炎6例,胃癌5例);从畸形人群当选取9例作为畸形对比组。粪便标本提取组织DNA后,以C255F/C255R特异性引物进行PCR扩增,所得PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,阳性者进一步测序鉴定;所收集血清标本进行ELISA分析,结合粪便PCR成果断定cutoff值。2.7利用ELISA血清学检测方法初步探讨人类H.hepaticus感染情况选取2007年11月至2009年3月期间在南方病院消化科确诊的220例住院病人,其中肝脏疾病62例(包含肝炎后肝硬化33例,肝癌29例),结肠癌26例,肠道溃疡性病变36例(包含克罗恩病15例,溃疡性结肠炎21例),肠道感染性及增生性病变33例(包含肠炎8例,肠息肉23例,肠结核2例),十二指肠溃疡16例,胃部疾病41例(包含单纯性胃炎23例,胃癌18例),其它肿瘤5例;从畸形人群当选取13例作为畸形对比组。收集血清标本进行ELISA分析,以断定的cutoff值断定阳性与阴性成果。2.8数据的统计学分析采取SPSS13.0统计软件进行分析,均数用M±SD表示,配对计数材料跟多个样本率的比较采取χ~2测验,明显性水准(significantlevel)α=0.05,P＜0.05认为成果有明显性差别。成果1、MCP原核表白质粒的构建以肝螺杆菌全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增获得了约255bp的MCP基因片段,克隆至原核表白载体pET22b(+)后经测序与GenBank数据库颁布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列完全一致(DNA测序由上海英骏公司实现),成功构建MCP的原核表白质粒pET22b+/MCP。2、重组融合蛋白的引诱表白经IPTG引诱后,含重组质粒的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)可能表白绝对分子品质M:14118D的重组蛋白rhMCP,SDS-PAGE鉴定后可知rhMCP重要存在于积淀部分,即rhMCP是以不可溶性的包涵体情势存在。经Westernblot鉴定,在约14KD处可见一特异性条带。3、重组蛋白的分别纯化因为引诱表白的rhMCP是以不可溶的包涵体情势存在,因此用8M尿素溶解包涵体,再按变性蛋白纯化方法进行梯度尿素洗脱,其中以UrNTA200(咪唑浓度为200mM)洗脱后果最佳,纯化后的rh（此处忽略..）MCP用透析袋进行梯度尿素-PBS透析复性,复性后得到可溶性rhMCP,用BCA法测蛋白浓度为0.73mg/ml。4、小鼠H.hepaticus感染血清学分析以小鼠肠粘膜组织提取的基因组DNA作为模板,用肝螺杆菌特异性引物C255F/C255R进行PCR扩增,测得阳性标本22例,阴性标本31例,从阳性标本中随机抽取5例进行DNA测序,测序成果与GenBank颁布的MCP基因序列完全一致。以rhMCP作为检测抗原,小鼠血清作为待测样本,进行ELISA血清学检测,以31例阴性标本(以PCR检测断定)的OD值均数+2倍标准误(即M+2SE)作为ELISAcutoff值,则cutoff值为0.390,灵敏度为72.7%,特异度为77.4%。配对计数材料χ~2测验可知ELISA与PCR两种检测方法无明显性差别(P=1.000,P＞0.05(双侧)),且两种诊断方法的吻合度有统计学意思但吻合度个别(κ=0.498,P=0.000)5、人类H.hepaticus感染的ELISA血清学检测临界值断定肝螺杆菌特异性引物C255F/C255R扩增所收集病例粪便基因组DNA,测得59例标本中阳性者为27例,阴性者为32例,其中畸形对比组中阳性者2例,阴性者7例。阳性标本的PCR产物进一步进行DNA测序鉴定,测序成果与GenBank颁布的MCP基因序列一致性达99%,仅第42位碱基产生基因缺失(PCR产物测序由上海英骏公司实现)。以rhMCP作为检测抗原,人血清作为待测样本,进行ELISA血清学检测,以畸形对比组中7例PCR阴性标本的ELISAOD均匀值加2倍标准误(即M+2SE)为cutoff值,则cutoff值为1.081,灵敏度为77.8%,特异度为71.9%。配对计数材料χ~2测验可知ELISA与PCR两种方法在检测Hh感染方面无明显性差别(P=0.607,P＞0.05(双侧)),且两种诊断方法的吻合度有统计学意思但吻合度个别(κ=0.492,P=0.000)。6、利用ELISA血清学检测方法初步探讨人类H.hepaticus感染情况所收集的233例血清标本以重组蛋白rhMCP作为检测抗原,经ELISA血清学检测估计肝脏疾病组、结肠癌组、肠道溃疡性病变组、肠道感染性及增生性病变组、十二指肠溃疡组、胃部疾病组、其它肿瘤组Hh检测阳性率分辨为74.2%、63.0%、66.7%、57.6%、37.5%、39.0%、20.0%。χ~2测验可知各组ELISAHh检测总体阳性率有明显性差别(χ~2=23.587,P=0.001,P＜0.05)。实验初步发明患肝脏及肠道疾病的病人中Hh阳性率较高（此处忽略..）,揣测在肝螺杆菌可能定植的肝脏及肠道部位所患疾病的患者中HhELISA血清学检测阳性率较高。论断本研究通过分子克隆技巧,在原核表白体系中成功构建MCP的原核表白质粒pET22b+/MCP,并利用IPTG引诱表白、分别纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。以rhMCP作为检测抗原,以粪便PCR方法做为金标准,通过ELISA血清学方法检测人血清中的特异性免疫球蛋白,初步断定肝螺杆菌ELISA血清学检测方法的临界值,并揣测肝螺杆菌可能定植部位所患疾病Hh检测阳性率较高,为进一步考察我国肝螺杆菌人群感染率及探讨人类肝脏疾病跟肠道非特异性炎症的病因提供实验基本。

以上为本篇毕业论文范文肝螺杆菌甲基基团接收趋化信号转导蛋白的克隆表白纯化及血清学利的介绍部分。

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