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家兔皮肤液化病理模型与分枝杆菌毒力差别相干性研究及结核整合蛋

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毕业论文范文题目:家兔皮肤液化病理模型与分枝杆菌毒力差别相干性研究及结核整合蛋,论文范文关键词:家兔皮肤液化病理模型与分枝杆菌毒力差别相干性研究及结核整合蛋
家兔皮肤液化病理模型与分枝杆菌毒力差别相干性研究及结核整合蛋毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:1.家兔皮肤液化病理模型与分枝杆菌毒力差别相干性研究目标:利用卡介苗BCG、结核分枝杆菌减毒株H37Ra、耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis(M.smegmatis)以及H37Ra互补株(分辨重组了11种来源H37Rv野生型基因的H37Ra菌株)感染家兔皮肤,察看皮肤病理变更情况,可能疾速有效地评估不同分枝杆菌毒力以及引起家兔皮肤液化才能的差别。方法:实验一中家兔随机分成6组,分辨进行腹部两侧皮内打针5×106CFU的BCG、H37Ra跟M.smegmatis的活菌液跟热灭活菌液;距首次免疫后约42天,每组以雷同剂量的同种菌液对家兔进行再次皮内免疫,察看家兔皮肤病理变更。实验二中家兔随机分成13组,设破H37Ra株跟pOLYG载体组为对比组,实验组为H37Ra互补株组包含P10、P11、P12…P20组。以上菌株分辨感染家兔皮肤,每组打针剂量分为三种即高剂量(5x107CFU)、中剂量(5×106CFU)、低剂量(5x105CFU)。六周掉队行再次免疫,察看家兔皮肤伤害情况。成果:实验一,家兔分辨经皮内接种BCG、H37Ra跟M.smegmatis的活菌液跟热灭活菌液后,活菌组家兔可能察看到皮肤有明显的炎症反应跟脓肿构成以及液化、溃疡的产生;而热灭活组都不能引起家兔皮肤产生明显的病理变更。再次免疫后可能发明各组病理反应程度会(文章此处忽略..)加重。活菌组引起家兔皮肤病变的重大程度为:BCG引起的病变反应最强,其次是H37Ra,M.smegmatis的反应最弱。实验二,H37Ra互补株感染家兔皮肤当前,高剂量组(5x107CFU)跟中剂量组(5×106CFU)均可引诱产生强烈的家兔皮肤病理改变。对不同H37Ra互补株,所引起的病灶反应程度存在差别:H37Ra互补株P10(重组了H37Rv的基因pstAl)引起的病灶体积最大,其次是P19(lpdA)、P17(padA)、P15(mazG)、P18(dH)、P14(pknH)(*p=0.05vs.H37Racontrol)。然而,P11(phoP)、P12(marRfamily)、P13(luxR/uhpAfamily)、P16(nadD):跟]P20(ilvD)与载体对比pOLYG跟H37Ra引起的病灶反应比较类似。与其余组比拟,P18(dH)跟P14(pknH)能促使家兔皮肤病灶产生最强烈的液化反应;P10(pstAl)、P11(phoP)、P13(luxR/uhpAfamily)、P16(nadD)跟P20(ilvD)组的液化强度与对比组pOLYG跟H37Ra比较不明显差别。论断:剂量(5×106CFU)的活菌BCG、H37Ra跟M.smegmatis可能引起家兔皮肤产生液化景象,其中BCG组病灶反应最强烈,其次是H37Ra组,最弱为M.smegmatis组。当分枝杆菌被灭活后,便丧失了引发液化反应的才能。而且利用这种家兔皮肤模型可能有效评估不同(此处忽略..)H37Ra互补株引起的病理变更的差别。2.无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B/TB10.4-Ag85B/ESAT6-TB8.4/TB10.4-TB8.4的克隆构建跟免疫原性检测目标:克隆构建无标签结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B/TB10.4-Ag85B/ESAT6-TB8.4/TB10.4-TB8.4,并利用动物实验对此融合蛋白的免疫原性进行初步评估。方法:利用分子克隆技巧设计含有不同酶切位点的ESAT6、TB10.4、TB8.4跟Ag85B的引物,以H37Rv-DNA为模板PCR扩增出相应大小的基因片段,通过基因工程技巧进行重组而获得重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B/pET30a-TB10.4-Ag85B/pET30a-ESAT6-TB8.4/pET30a-TB10.4-TB8.4。将重组质粒转化入大肠杆菌菌株BL21,进行IPTG引诱表白,采取IEX(离子交换色谱层析)跟HIC(疏水作用色谱层析)两种方法进行融合蛋白的纯化。最后将蛋白与佐剂DDA混淆配制成蛋白疫苗进举动物实验,将C57BL/6小鼠随机分成9组,设破PBS、BCG跟单个抗原作为对比组,融合蛋白组为实验组。免疫后第14周采取ELISA技巧检测免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞分泌INF-y程度。成果:PCR扩增获得的ESAT6、TB10.4、TB8.4跟Ag85B序列与GenBank中完全一致。融合蛋白在大肠杆菌中表白产(本文此处忽略..)物与预计大小相吻合,融合蛋白ESAT6-Ag85B分子量约38KD、融合蛋白TB10.4-Ag85B分子量约42KD,二者以包涵体的情势表白,最后利用离子交换层析跟疏水层析可纯化此两种复性后的蛋白;融合蛋白ESAT6-TB8.4分子量约18KD、融合蛋白TB10.4-TB8.4分子量约19KD,二者以上清液表白为主,利用离子交换层析跟疏水层析可纯化此两种可溶性蛋白。ELISA检测成果显示:免疫后小鼠脾脏淋巴细胞受单个蛋白ESAT6跟TB8.4刺激当前,融合蛋白ESAT6-TB8.4组产生的IFN-y高于BCG组跟ESAT6组(**p0.05vs.BCGandESAT6)。与BCG组、TB8.4组比拟,当受单个蛋白TB8.4刺激当前,融合蛋白TB10.4-TB8.4组分泌IFN-y程度高于BCG组跟TB8.4组(**p0.05vs.BCGandTB8.4);而针对TB10.4特异性抗原表位刺激时,融合蛋白TB10.4-TB8.4组分泌IFN-γ程度高于BCG组(p0.05vs.BCG)。受单个蛋白Ag85B跟ESAT6刺激当前,融合蛋白ESAT6-Ag85B组产生的IFN-y量与对比BCG组比拟,都有明显的差别(*p0.05vs.BCG)。最后,免疫后小鼠脾脏淋巴细胞受单个蛋白Ag85B跟TB10.4特异性抗原表位刺激时,融合蛋白TB10.4-Ag85B组,产生的IFN-y量与对比BCG组比拟,有明显的差别(*p0.05vs.B(文章此处忽略..)CG)。论断:成功构建了不带有标签的结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B、TB10.4-Ag85B、ESAT6-TB8.4跟TB10.4-TB8.4,且利用不同的色谱柱使融合蛋白得到了有效的纯化;动物免疫实验显示融合蛋白较单个抗原有更强的免疫原性。上述融合蛋白将用于构建结核亚单位候选疫苗,进一步评估其免疫保护后果。


以上为本篇毕业论文范文家兔皮肤液化病理模型与分枝杆菌毒力差别相干性研究及结核整合蛋的介绍部分。
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