禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S_1基因玉米表达载

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禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S_1基因玉米表达载

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【论文摘要】：本研究设计了一对引物M1/M2，通过RT-PCR的方法成功地扩增了8株IBV中国地方分离株SAIB_4、SAIB_6、SAIB_9、SAIB_(14)、SAIB_(20)、SAIB_(WJ)、SAIB_(RC)、和SAIB_(RCH)M基因的目的片段，并通过克隆、序列测定获得了8株分离毒株M基因的核苷酸序列，并在国际基因库GenBank中注册，8株分离毒株M基因全长678bp-681bp，编码225-226个氨基酸残基。将M基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列（此处忽略..）进行比较的结果表明IBV分离株彼此间的核苷酸同源性为87.1％-100％，其相应的氨基酸序列的同源性为88.1％-100％。核苷酸序列前150bp的变异最大，不同毒株间存在插入、缺失及点突变等。M基因核苷酸系统进化树分析结果表明8株IBV分离株可分为2个基因群，SAIB_4、SAIB_6、SAIB_(WJ)、SAIB_(14)、SAIB_(RC)和SAIB_(RCH)属于Ⅰ群，与Mass型参考毒株的亲源关系较近，SAIB_9和SAIB_(20)属于Ⅱ群，其（此处忽略..）中SAIB_(20)与Gray等肾型毒株亲缘关系较近。本研究选取具有代表意义的分离株SAIB_(14)和SAIB_4，设计了引物L1和L2，以其S1基因克隆质粒pUCSAIB_(14)和pUCSAIB_4为模板，用具有高保真度的pfu酶分别扩增到S_1基因片段。把扩增产物分别通过ClaI和BamHI酶切纯化，连接到用ClaI和BamHI切去GFPml基因的中间表达载体pUGFPocs中，转化大肠杆菌JM109，在含Amp(100μg/ml（文章此处忽略..）)的LB抗性平板上筛选到了的阳性菌落。提取质粒通过酶切和PCR分析获得了中间载体重组质粒pUSAIB_(14)和pUSAIB_4；用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB_(14)和pUSAIB_4，回收Ubi-S_1-Tocs片段，定向插入到pCAMBIA1300载体的多克隆位点，并转化大肠杆菌JM109，在含Kan(60μg/ml)的LB抗性平板上筛选到了阳性菌落，提取质粒通过酶切和PCR分析获得了玉米表达载体重组质粒pC（此处忽略..）USAIB_(14)和pCUSAIB_4。IBVS1基因玉米高效表达载体的成功构建将为进一步进行IBVS1基因在玉米中的表达和免疫保护性研究打下了基础。

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