幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究

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幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究

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毕业论文范文题目：幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究，论文范文关键词：幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究
幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标:幽门螺杆菌(H.pylori)的寰球感染率超过了50%,它是慢性活动性胃炎跟消化性溃疡的重要病因,与肠型胃癌跟胃黏膜相干淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的产生密切相干。现有的铲除H.pylori的手段重要是结合利用抗生素,但因为该菌感染的广泛性、耐药菌株的始终增加、较高的花费以及病人的低依从性等,限度了抗菌药物的疗效。因此,接种简便、本钱低廉并易于大面积推广的H.pylori疫苗的研究非常急切。在疫苗研究中,筛选有效的免疫抗原是关键性的环节。目前大多数疫苗采取的是与Hp致病相干的毒力因子作为抗原成分,如尿素酶(urease)、热休克蛋白(heatshockprotein,Hsp)、空泡毒素(vacuolatingcytotoxin,VacA)、细胞毒素相干抗原(cytotoxinassociateantigen,CagA)、中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activatingprotein,NAP)等。革兰氏阴性细菌外膜蛋白存在良好的抗原活性,这些外膜蛋白作为抗体跟免疫细胞攻打的重要靶标,可能介导对细菌最直接有效的杀灭作用,是决定免疫反应是否对人体存在保护性的关键因素。OMP18跟UerB都是Hp的外膜蛋白成分,其编码基因存在高度保守性,也是Hp疫苗重要的免疫抗原。但始终令学者们遗憾的是每种抗原单独免疫动物时,获得的保护率均不是很高,而多种抗原结合免（文章此处忽略..）疫才干达到较好的后果。因此,本研究拟对上述二种保护性抗原基因进行克隆表白,并与分子内佐剂LTB串联得到多亚单位的融合蛋白,分辨察看在小鼠体内引诱的不同免疫应答跟保护作用,为筛选有效的H.pylori疫苗抗原奠定基本。方法:1、采取PCR方法从H.pylori临床分别株9806基因组中扩增OMP18基因片段并构建在原核表白载体pQE-30中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。利用生物信息学软件DNAssist跟GenBank数据库对已颁布的H.pyloriOMP18基因序列进行类似性分析。将含目标基因片段的重组载体转化大肠杆菌M15中,经IPTG引诱表白,用AKTA-explore纯化仪纯化表白的重组蛋白rOMP18。利用Tris-Tricine方法对表白产物跟纯化产物进行分析,用纯化的rOMP18免疫家兔,并采取Westernblot跟免疫扩散实验鉴定重组蛋白的免疫性。2、采取重叠延长PCR的方法,分辨以UreB414活性片段做为融合蛋白前端,与OMP18及粘膜佐剂LTB顺次串联,跟以粘膜佐剂LTB做为融合蛋白前端与OMP18顺次串联,在片段间引入5个氨基酸的linkerPQDPP进行连接;将融合基因构建在原核表白载体pET-28a中,经酶切及测序鉴定后,阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21(DE3),IPTG引诱重组工程菌表白。Tris-Tricine电泳跟免疫印迹鉴定融合蛋白,DNAs（本文此处忽略..）sist软件分析融合蛋白理化特点,通过纯化前提摸索,AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白LTB-OMP18(LO)跟UreB414-OMP18-LTB(UOL)。纯化后的融合蛋白分辨与GM1神经节苷脂进行结合实验。3、将144只小鼠随机分为6组:PBS对比组、单亚单位分子内佐剂融合蛋白组(UreB414-LTB)、双亚单位分子内佐剂融合蛋白组(UreB414-OMP18-LTB、)单一亚单位分子内佐剂融合蛋白组(LTB-OMP18)、体外物理混淆组(rOMP18+UreB414-LTB)无分子内佐剂单一亚单位蛋白组(OMP18)。分辨于0、7、14、28天口服免疫,剂量为150μg/只/次。术次免疫后10天,每组取12只小鼠剖杀取样,ELISA检测口服免疫后血清特异性IgG、IgA,粪便、肠道冲刷液sIgA程度。每组余下12只口服10~8CFUHp小鼠适应株,30天后,取小鼠胃部标本通过Hp培养及特异性PCR检测,断定Hp感染率,并打算口服免疫后各组攻毒保护率。成果:1、经酶切鉴定跟基因测序成果显示,H.pyloriOMP18基因被正确克隆到pQE-30中。OMP18基因的核苷酸序列长度为540bp,与GenBank中序列比较,同源性为99%,氨基酸序列的同源性为100%。重组工程菌IPTG引诱,经Tris-Tricine分析,表白的目标蛋白分子量约为20KD,其表白产物占菌体蛋白的20%,为包涵体情势表白,经AKTA-explore100蛋白纯化体系纯化,纯化后得到纯度＞85%的目标蛋白。以纯化蛋（略..）白为抗原加弗氏佐剂免疫家兔,制备兔抗rOMP18特异抗体,经免疫双扩散法检测,兔抗血清抗体效价为1:32,WesternBlot成果也显示重组蛋白能被兔抗H.pylori血清所辨认。2、经酶切鉴定跟基因测序成果显示,成功构建了融合基因LTB-OMP18跟UreB414-OMP18-LTB,将融合基因LO跟UOL克隆到pET28a载体上,得到融合蛋白表白载体pLO跟pUOL,DnaStra软件评估蛋白linker存在较好的柔韧性。将两个阳性重组子转化至E.coliBL21(DE3)后,37℃培养经IPTG引诱,表白的融合蛋白经SDS-PAGE跟免疫印迹分析显示分子量约为31KD跟43KD。UVP扫描证明融合蛋白表白约占总蛋白的25%跟20%。包涵体鉴定实验证明融合蛋白重要以包涵体情势表白,断定了采取亲跟层析的纯化方法。纯化后得到纯度＞85%的融合蛋白。纯化后的两个融合蛋白分辨能与GM1神经节苷脂产生结合反应,实验证明重组融合蛋白中LTB组分存在与GM1神经节苷脂结合的生物活性,阐明融合蛋白保持了LTB的天然活性,存在粘膜佐剂活性。3、ELISA检测融合蛋白rLO跟rUOL免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA,粪便、肠道冲刷液sIgA程度与PBS组比拟,升高超显,差别极明显(p＜0.001),与亚单位免疫组比拟,差别明显(p＜0.05),与多亚单位蛋白物理混淆组比拟,差别不明显(p＞0.05)。免疫攻毒后,免疫保护率为:rLO组67%(8/12),rU（略..）OL组83%(10/12)。统计分析显示,多亚单位融合蛋白组免疫保护率与PBS组比拟,差别极明显(p＜0.001),与rOMP18组比拟,差别明显(p＜0.05),与rOMP18+UreB414-LTB组比拟,差别不显差(p＞0.05)。论断:1、成功克隆了H.pyloriOMP18基因,与GenBank已颁布的H.pylori菌株基因序列存在高度同源性。纯化的重组蛋白rOMP18,存在良好的免疫原性跟免疫反应性,可能作为H.pylori基因工程疫苗候选抗原。2、成功构建、表白融合蛋白rLO跟rUOL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独破免疫反应性,融合基因间的Linker对融合蛋白的破体构象影响较小。3、小鼠体内特异性抗体程度及免疫保护后果都证明融合蛋白rLO跟rUOL存在良好的保险性跟免疫保护后果。

以上为本篇毕业论文范文幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究的介绍部分。

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