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PAM14与Sedlin彼此作用的初步研究

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毕业论文范文题目：PAM14与Sedlin彼此作用的初步研究，论文范文关键词：PAM14与Sedlin彼此作用的初步研究
PAM14与Sedlin彼此作用的初步研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标利用酵母双杂交技巧懂得Sedlin/PAM14(proteinassociatedwithMRG,14kD)之间的彼此作用,并构建PAM14缺失渐变体以及Sedlin的点渐变体,研究它们在酵母中的彼此作用的具体位点。构建带GFP标签的Sedlin的表白载体跟带HA标签的PAM14的表白载体,将其共转染至COS7细胞,察看其在细胞内的共定位的具体情况。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pCDNA3.1-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14的cDNA序列,用限度性内切酶酶切PCR产物,回收目标片段,连接到酵母体系2提供的载体pACT2上,构建表白载体pACT2-PAM14。用类似的方法构建pCDNA3.1-HA-PAM14,pCDGFP-Sedlin。用SmaⅠ把PAM14酶切为两段(N端254bp,编码84个AA,标记（略..）为PAM14-N),回收酶切的N端,连接到pACT2上,构建成PAM14的缺失渐变体pACT2-Pam14-N。用PCR的方法构建PAM14的另一缺失体pACT2-Pam14-C(编码43个AA)。以pAS-Sedlin为模板,构建Sedlin定点渐变(S124A)质粒pAS-SedlinS。以两条含有渐变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用DpnⅠ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感触态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序。把构建的酵母表白载体分成三组转化酵母感触态,检测它们彼此作用的情况。将pACT2/pAS-Sedlin,pACT2/pAS-Sedlin-N,pACT2-PAM14/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14/pAS-Sedlin-N等质粒分辨共转化入酵母菌Y190,再通过滤膜印迹实验测定β-（本文此处忽略..）半乳糖苷酶活性。呈蓝色的克隆是两种蛋白可能彼此作用的阳性克隆。将pACT2/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14-N/pAS-Sedlin,pA-CT2-PAM14-C/pAS-Sedlin等质粒分辨共转化入酵母菌Y190,再通过滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性。呈蓝色的克隆是两种蛋白可能彼此作用的阳性克隆。将pACT2/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14/pAS-SedlinS等质粒分辨共转化入酵母菌Y190,研究它们在酵母中的彼此作用情况。将构建正确的质粒pCDNA3.1-HA-PAM14,pCDGFP-Sedlin共转染COS7细胞,制造免疫荧光片,在荧光显微镜下察看它们在细胞内的定位。根据荧光片察看的成（文章此处忽略..）果分析,初步断定它们共定位于核仁。将pCDNA3.1-HA-PAM14,pCDGFP-Sedlin共转染至HEK293T细胞,培养48h,用蔗糖密度梯度离心法提取核仁。将得到的核仁制造成免疫荧光片分析并进行westernblot分析。成果构建了渐变体pAS-SedlinS;养分筛选跟β-半乳糖苷酶活性测定均表明共转化入Y190的质粒中,仅pACT2-PAM14/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14-N/pAS-Sedlin,pACT2-PAM14/pAS-SedlinS等为阳性,其余多少组均为阴性;pCDNA3.1-HA-PAM14跟pCDGFP-Sedlin在COS7细胞中共定位于细胞核。将pCDNA3.1-HA-PAM14,pCDGFP-Sedlin转染至HEK293T细胞,用蔗糖梯度离心法提取核仁,免疫荧光片察看发明（文章此处忽略..）,在核仁中存在两者的共定位。Westernblot分析,两者同样存在于提取的核仁积淀中。论断利用酵母双杂交体系2验证了Sedlin与PAM14之间的彼此作用;PAM14氨基端的84个氨基酸残基对Sedlin与PAM14的彼此作用是必须的,Sedlin羧基端S124位氨基酸残基对它们的彼此作用不是必须的。Sedlin与PAM14在HEK293T细胞中是彼此作用的,并且两者在COS7细胞中共定位于核仁。

以上为本篇毕业论文范文PAM14与Sedlin彼此作用的初步研究的介绍部分。

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