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L1插入序列对GFP报告基因表白的影响

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毕业论文范文题目：L1插入序列对GFP报告基因表白的影响，论文范文关键词：L1插入序列对GFP报告基因表白的影响
L1插入序列对GFP报告基因表白的影响毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标基因组测序发明,在哺乳动物的基因组中,单拷贝基因内跟基因之间分布着大量的转座子,这些转座子曾经被认为是无用的“垃圾序列”。这些转座子中最有代表性的就是LINE-1(longinterspersednuclearelements1,长分布反复序列1,简称L1)。L1是人类基因组中含量最多的自主性逆转录转座子,约占人类基因组DNA的17%。哺乳动物基因组中约1/3的成分都直接或间接跟L1逆转录转座有关。L1有2个开放读码框(openedreadingframe),编码2种蛋白质:ORF1——编码的蛋白有RNA结合活性,ORF2——编码的蛋白有核酸内切酶跟逆转录酶两种活性,2种蛋白都是L1转座所必须的。迄今为止已发明L1与多种生物学景象关联,包含基因渐变,X染色体失活,基因重排,基因表白沉默,肿瘤产生,生物进化等。在机体免疫体系中,T细胞跟B细胞抗原受体等位基因排斥,IL-2、IL-4的基因表白都与L1有关。最近,已有研究表明:L1序列可能下调基因的表白——Han将L1.2的ORF2(L1反复序列的一部分)跟LacZ分辨插入到GFP报告基因下游。与插入LacZ的序列比较,ORF2明显减少GFP蛋白质的产生,使GFP的RNA生成量减少70倍。当改变下游插入片段ORF2的读码框时,GFP的表白仍然受到雷同的克制造用。Han同时还察看到,插入反义ORF2也克制GFPRNA跟GFP蛋白质的产生,然而作用较弱。已知L1有10个家（本文此处忽略..）族,根据其ORF2跟3'非翻译区同源性进行分类,这10个家族又可能分为75种亚家族,各个亚家族之间存在序列上的差别。因此,上述L1序列下调基因表白的成果是否对其它L1亚家族也是如此,尚未得悉。更兼最近还有文献报道,在GFP-L1转基因小鼠中,GFP报告基因可能在小鼠睾丸中表白,然而在其它组织不表白,很明显L1成分参加调控基因表白在不同的细胞中也不雷同。因此,有必要研究L1序列参加调控基因表白的不同影响因素。为此,本文拟用L1PA3(L1序列的一个亚家族)序列上的ORF2为研究对象,从ORF2调节基因表白的角度出发,揭示L1序列调控基因表白的影响因素,为进一步探讨L1下调基因表白的潜在机制,提供实验根据。方法1按照引物设计准则,设计目标序列的引物,采取PCR技巧,扩增目标序列作为插入片段。在引物中参加合适的酶切位点,根据实验须要采取双酶切或单酶切。2抉择pEGFP-C1作为载体,先将载体跟插入片段用雷同的限度性内切酶酶切,而后用T4DNA连接酶连接。转化DH5α菌株,PCR法筛选阳性克隆,进一步用酶切跟测序鉴定。3用LipofectamineTM2000将重组质粒刹时转染HeLa细胞。荧光显微镜下计数GFP荧光阳性细胞数,在白光下计数同样视线的细胞总数(每个样本至少500个),打算荧光阳性细胞百分率。在白光跟荧光下分辨对同一视线照相。成果1重组质粒鉴定将PCR扩增的ORF2正、反序列插入pEGFP-C1质粒,经限（略..）度性内切酶(XhoⅠ跟PstⅠ)消化鉴定跟测序分析,成功构建了重组质粒p-ORF2,p-ORF2as。将PCR扩增的LacZ正、反序列插入pEGFP-C1质粒,经限度性内切酶(XhoⅠ跟PstⅠ)消化鉴定跟测序分析,成功构建了重组质粒p-LacZ,p-LacZas。将PCR扩增的ORF2/A(ApaⅠ酶切)跟ORF2/Am(ApaⅠ酶切,读码框改变)的反序插入pEGFP-C1质粒,经过测序分析,成功构建了重组质粒p-ORF2as/A,p-ORF2as/Am。将PCR扩增的SV40polyA反序插入p-ORF2as/Am质粒ORF2as/Am片段上游的PstⅠ酶切位点,经过测序分析,成功构建了重组质粒p-Aas-ORF2as/Am。2插入ORF2跟LacZ正、反序对GFP基因表白的影响在pEGFP-C1质粒GFP基因下游按正、反方向插入ORF2跟LacZ,共有p-ORF2,p-ORF2as,p-LacZ,p-LacZas四种重组质粒,用pEGFP-C1作为对比,转染HeLa细胞,荧光显微镜察看,转染细胞的荧光细胞阳性率为:p-ORF2(0.53±0.10)%p-ORF2as(2.28±0.66)%p-LacZ(1.82±0.31)%p-LacZas(1.07±0.33)%pEGFP-C1(23.88±0.93)%3插入ORF2as/A,ORF2as/Am及polyAas-ORF2as/Am对GFP基因表白的影响以ORF2as为重要研究对象,先将改变酶切位点的ORF2as/A片段插入pEGFP-C1质粒G（文章此处忽略..）FP基因下游,构建p-ORF2as/A。再改变ORF2as/A片段的读码框,构建p-ORF2as/Am。最后在ORF2as/Am上游插一段polyAas,构建p-Aas-ORF2as/Am。连同p-ORF2as、pEGFP-C1共5种质粒,转染HeLa细胞,荧光显微镜察看,转染细胞的荧光细胞阳性率为:p-ORF2as(2.5±0.92)%p-ORF2as/A(10.6±0.65)%p-ORF2as/Am(0.39±0.10)%p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)%pEGFP-C1(24.13±1.43)%4荧光表白分析(1)p-ORF2(0.53±0.10)%,p-ORF2as(2.28±0.66)%,p-LacZ(1.82±0.31)%跟p-LacZas(1.07±0.33)%的荧光细胞阳性率明显低于对比pEGFP-C1(23.88±0.93)%的荧光细胞阳性率(P0.01)。(2)转染p-ORF2(0.53±0.10)%的荧光细胞阳性率明显低于p-ORF2as(2.28±0.66)%,p-LacZ(1.82±0.31)%跟p-LacZas(1.07±0.33)%的荧光细胞阳性率(P0.05)。(3)转染p-ORF2as/A(10.6±0.65)%的HeLa细胞荧光阳性率高于p-ORF2as(2.5±0.92)%的荧光阳性率(P0.01)。(4)转染p-ORF2as/Am(0.39±0.10)%的HeLa细胞荧光阳性率明显低于p-ORF2as/A(10.6±0.65)%的荧光阳性率(P0.01)。(5)转染p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)%的HeLa细胞荧光阳性率明显高于p-ORF2as/Am(0.39±0.10)%的荧光阳性率(P0.01)。论断1在pEGFP-C1质粒的GFP基因下游插入片段大小雷同,但序列不同的DNA片段时,均能克制上游GFP基因的表白,且不同序列克制造用的强弱（文章此处忽略..）不同,ORF2正序克制造用最强。2雷同的ORF2as片段插入到GFP下游的不同酶切位点,对GFP的克制造用不雷同。3ORF2as片段插入pEGFP-C1质粒的同一个酶切位点,读码框改变后,GFP基因的表白不同。4SV40polyA反向插入到改变读码框的ORF2as上游时,可能部分解除ORF2as对GFP基因的克制造用。

以上为本篇毕业论文范文L1插入序列对GFP报告基因表白的影响的介绍部分。

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