盘基网柄菌突变细胞亚显微结构及gp150蛋白原核表达与纯化研究

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盘基网柄菌突变细胞亚显微结构及gp150蛋白原核表达与纯化研究

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毕业论文范文题目：盘基网柄菌突变细胞亚显微结构及gp150蛋白原核表达与纯化研究，论文范文关键词：盘基网柄菌突变细胞亚显微结构及gp150蛋白原核表达与纯化研究
盘基网柄菌突变细胞亚显微结构及gp150蛋白原核表达与纯化研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)是一种低等的单细胞真核原生生物,隶属原生动物门网柱超纲.营养丰富的条件下,以单细胞形式存在,在饥饿状态下,细胞开始发生聚集,野生型细胞株KAx-3经过细胞聚集阶段,细胞丘,蛞蝓体和子实体阶段,最终形成由柄细胞和孢子细胞组成的子实体。由于其发育周期短,生命现象丰富,发育程序受到精密的调控,成为了研究细胞分化,细胞发育,细胞信号传导、形态发生等的良好模式生物。gp150是盘基网柄菌细胞丘时期表达的异嗜性粘附分子,是细胞发育的一种必需分子,在蛋白分类上属于跨膜蛋白,由LagC基因编码,一个97kD糖蛋白。gp150缺失的细胞株AK127缺乏该蛋白,发育被阻滞在细胞疏松聚集阶段,不能完成最终发育,可见gp150蛋白在盘基网柄菌发育过程中起着重要作用,它可能参与介导细胞分化和凋亡的信号转导途径,但具体的信号通路至今仍未完全清楚。因此本研究一方面通过形态学研究观察gp150缺失的细胞株AK127的超微结构,一方面用分子生物学的手段对gp150蛋白进行原（此处忽略..）核表达,为深入探究其结构和功能关系提供理论基础。野生型细胞发育14h后,细胞处于发育关键点,而处在相同发育时间段的AK127突变细胞的亚显微结构特征未见有报道,为搞清发育期间AK127细胞亚显微结构特征,本研究用透射电镜观察了发育14h、16h、20h的细胞,结果发现：发育14h细胞内含丰富内质网系统,由内质网组织围裹细胞质密度明显低于周围的细胞质,能清楚地观察到多层膜组成的多膜结构。据此我们推测多膜结构最早起源于内质网系统。发育到16h时,多膜结构内某些膜开始解体,形成自噬泡。自此我们对自噬泡的起源也有了一个较明确的认识。发育20h细胞内有一个内含数个多膜结构的大自噬泡。据此我们推测多膜结构作为一个储备营养成分“仓库”,为维持细胞生命所用。自噬泡仅仅消化多膜的同心圆结构,并不损伤其他细胞器,帮助细胞度过饥饿环境,其功能与野生型细胞中的自噬泡明显不同。研究中还发现细胞核的内核膜产生凹陷,使内外核膜间产生一个含丝状物质的泡状空间,内核膜上可见螺旋状染色物质,外核膜表面布满颗粒状物质。这种局（文章此处忽略..）部空泡化的细胞核附近出现一些外被一圈颗粒状物质,内有低电子密度丝状物的小泡,而只有出现局部空泡化细胞核周围才出现上述小泡,因此我们推测这些小泡的出现很有可能是外核膜上布满颗粒状物质分泌到细胞质中导致的结果。我们观察到在发育的各阶段,线粒体数目丰富且嵴完整,既没有发生内自噬现象,也没有发生嵴瓦解现象。这与野生型的线粒体内自噬现象形成了对比,说明了线粒体结构变化与细胞分化有一定关系,突变细胞没有发生明显的细胞分化。这些数据为进一步分析gp150分子在细胞生长和发育过程中的作用提供了新的资料。深入研究gp150蛋白结构与功能,无疑会对我们理解细胞粘着及粘附分子在多细胞发育进程中的作用有重要意义。而探究蛋白质高级结构的前提是获得大量高纯度的蛋白,所以,本实验利用基因工程的方法,将gpl50全蛋白在大肠杆菌里进行了可溶性表达,SDS-PAGE电泳结果显示,含Actin15启动子的载体可以在大肠杆菌宿主菌BL21中启动目的基因的表达,目的条带的量约占全菌蛋白的15%左右。本实验接着采用离子（文章此处忽略..）交换法对gp150蛋白的纯化方法进行了初步探索。选取了CM、DEAE、Q三种离子交换树脂分别在三个PH梯度吸附条件下进行试验,由于蛋白表达量未达到理想程度,本实验室已保存的表达载体Actin15-LagC不含融合表达标签,离子交换树脂吸附的杂蛋白较多,蛋白分离纯化效果不理想。由于摸索最佳纯化条件还需要较长时间,离子交换法纯化蛋白的工作具有较大困难,所以后续工作用PCR方法从本实验室已保存的表达载体Actin15-LagC上扩增LagC基因,将其克隆至pET32a原核表达载体,重新构建了重组载体pET32a-LagC,构建的重组质粒带有6个组氨酸标签,经测序鉴定读码框完整准确,没有突变,成功地构建了gp150蛋白的原核表达载体,为进一步的蛋白融合表达,纯化和高级结构研究打下了基础,也为研究gp150蛋白在盘基网柄菌细胞发育中的作用提供必要前提和有力工具。本研究首次运用了生物信息学的方法对gp150蛋白进行了分析,采用Garnier-Robson和Chou-Fasman两种方法进行gp150蛋白二级（此处忽略..）结构预测,并应用Kyte-Doolittle的亲水方案、Emini的蛋白质表面可能性方案、Karplus-Sohulz的柔性蛋白预测方案和.Jameson-Wolf的抗原指数方案进行综合分析,预测结果表明该蛋白形成a螺旋结构的能力较弱,a螺旋存在于第348～353,598～602,685～688,731～732,733～734区段,具有较多的B折叠和转角结构单元,β折叠存在于5～16,26～30,34～40,46～52,69～72,98～101,116～123等40多个区段,gp150蛋白的优势抗原表位在19～20,31～34,,72～76,101～105,264～267,371～173,517～521,697～699区段,为今后研究gp150蛋白的高级结构和功能提供一些借鉴。

以上为本篇毕业论文范文盘基网柄菌突变细胞亚显微结构及gp150蛋白原核表达与纯化研究的介绍部分。

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