实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用

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实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用

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毕业论文范文题目：实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用，论文范文关键词：实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用
实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：本文围绕检测1型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-1)的一步法荧光定量反转录聚合酶链式反应(real-timereversetranscriptase-polymerasechaieaction,rRT-PCR)诊断方法的建立和应用开展了系列研究:①建立了基于DHV-13D基因的一步法rRT-PCR;②应用该方法对DHV-1强毒在鸭胚内的分布规律和弱毒在鸡胚内的分布规律进行了研究;③定量检测人工感染DHV-1的雏鸭体内病毒动态分布情况;④定量检测感染DHV-1强毒后耐过雏鸭的病毒排泄规律,并对四川部分鸭场的健康鸭群和养鸭环境进行了流行病学调查。得到如下结果:根据DHV-13D区域序列,设计并合成了一对能特异性扩增87bp片段的引物和TaqMan~(TM)探针,建立了一步法rRT-PCR诊断方法。该法在DHV-1RNA含量为1×10~(10)-1×10~5copies有较好的线性关（此处忽略..）系;该法建立的标准曲线为Y=-3.431X+46.443,相关系数为1.000,PCR循环效率为95.6%,检测DHV-1RNA模板的灵敏度为10copies/反应;特异性试验表明只对DHV-1基因组呈阳性反应,而对鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病毒(H5N2亚型)、鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌(5:A)、鸭源肠炎沙门氏菌、鸭源鼠伤寒沙门氏菌和鸭源致病性大肠杆菌(078)、正常鸭胚尿囊液和健康鸭肝组织呈阴性反应。用建立的方法检测了DHV-1强毒在鸭胚中的增殖规律以及弱毒在鸡胚中的增殖规律,鸭胚和鸡胚分别在接毒后28-40h、44-56h病毒含量达到最大,胚体中为10~(11)copies/g数量级,尿囊液中为10~8-10~(10)copies/ml数量级。死亡胚内尿囊膜、肌肉中的病毒含量高于尿囊液、心、肝、脾、脑、肠。分别应用该技术和传统病毒分离和中和试验法检测10份来自人工感染（略..）雏鸭的肝脏以及40份临床疑似病鸭的肝脏,结果显示两种方法对人工感染病料的阳性检测结果符合率为100%,而rRT-PCR对临床疑似病料的阳性检测率极显著(P＜0.01)高于病毒分离和中和试验。研究结果表明,该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测,可用于DHV-1感染疑似病例检测、DHV-1体内动态分布规律研究及分子流行病学调查。应用建立的rRT-PCR方法对经肌注和口服途径人工感染DHV-1雏鸭的组织器官进行检测,结果表明:经肌注接种DHV-1后最早可在1h内从肝脏和哈德氏腺中检测到,2h即可在肌肉、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、胸腺中检测到;4h在空肠、回肠、盲肠中检测到阳性结果;感染后6h所有采集的样品中均能检测到DHV-1核酸的存在。6-72h之间各组织器官均能检测到DHV-1,肌注组出现高峰期的时间集中在24-48h。统计显示,肝脏、胸腺、哈德氏腺、（本文此处忽略..）盲肠、肾脏和肌肉的阳性拷贝数高于其它部位。除了肌肉、心脏、肺脏、胸腺、哈德氏腺和脑以外的其他组织器官直至攻毒后2w仍然能检测到病毒。经口服途径接种后,2h即在肝脏和哈德氏腺中最早被检测到,4h可在口服组的肌肉、心脏、脾脏、肾脏、十二指肠、胸腺中被检测到;感染后6h,除了肺脏、胰、盲肠和脑以外,其它所有采集的样品中均能检测到DHV-1核酸的存在。36-120h之间全部被检组织器官呈阳性反应,口服组出现高峰期的时间集中在48-72h。肝脏、胸腺、哈德氏腺、直肠和心脏的阳性拷贝数高于其它部位。到攻毒后2w,除了肌肉、肺脏、哈德氏腺和脑以外的其他组织器官仍然能检测到病毒。对肌注和口服两种途径感染DHV-1强毒耐过的雏鸭进行粪便排毒的检测,结果表明:口服组在60d之内已经有2只(2/5)停止排毒,到第120d已经全部(5/5)停止排毒。而肌注组在90d之内仅有1只(1/5)停止排毒,到了120d仍有2只(2/（本文此处忽略..）5)在排毒。同居组从第5d开始检测出有雏鸭感染,至第14d有4只(4/10)雏鸭感染。对四川部分地区鸭场采集样品进行检测,结果表明:饮水、戏水池、环境拭子和肛门拭子中均有可能检测出DHV-1,其中,从戏水池和肛门拭子中检出DHV-1的阳性率较高,饮水中检出DHV-1的概率较小,说明四川地区的鸭场有受到DHV-1威胁的可能,除了鸭的体内环境有利于病毒的生长繁殖外,非流动的戏水池环境也可存储病毒。

以上为本篇毕业论文范文实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用的介绍部分。

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